Bezpośrednie wykrywanie aktywności octanowej enzymu kinazy octanowej

Celem tego eksperymentu jest bezpośredni pomiar aktywności octanowej kinazy w kierunku syntezy octanu. Reakcję inicjuje się poprzez dodanie enzymu do mieszaniny reakcyjnej zawierającej fosforan acetylowy i substraty DP. Następnie dodaje się chlorek hydroksyloaminy, aby przekształcić pozostały fosforan acetylowy w hydroksylan acetylowy.

Dodaj roztwór wywoływujący, aby przekształcić acetylohydroksylan w barwny kompleks hydroksylanu żelaza(III), który można zmierzyć spektrofotometrycznie. Wyniki oparte na ilości substratu acetylofosforanu zużytego w reakcji umożliwiają oznaczenie parametrów kinetycznych enzymu. Przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że opiera się ona na bezpośrednim pomiarze zużycia acetylofosforanu, a nie na sprzężeniu produkcji ATP z redukcją ADP. Ponieważ ten test nie opiera się na produkcji ATP, może być stosowany dla nowej grupy kinaz octanowych, które produkują fosforan nieorganiczny zamiast ATP. W celu przygotowania krzywej wzorcowej składającej się z sześciu do ośmiu punktów, rozcieńcz roztwór zapasowy acetylofosforanu w 100 mM TRIS do końcowej objętości próbki 300 µL; należy również przygotować próbkę kontrolną bez acetylofosforanu. Wszystkie próbki inkubuj w bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez jedną minutę.

Następnie dodaj 50 µL 2 M chlorku hydroksyloaminy, wymieszaj wstrząsając trzy razy i inkubuj w bloku grzewczym o temperaturze 60 °C przez pięć minut. Następnie dodaj 100 µL roztworu wywoływującego, wymieszaj wstrząsając trzy razy i pozostaw do wywołania koloru przez co najmniej jedną minutę w temperaturze pokojowej. Odwiruj próbki, używając plastikowych kuwet do spektrofotometru.

Zmierzyć próbki przy długości fali 540 nanometrów. Następnie wyznaczyć krzywą wzorcową absorbancji przy 540 nanometrach w funkcji mikromoli acetylofosforanu, wykorzystując odpowiednie oprogramowanie do analizy danych i tworzenia wykresów. Obliczyć wartość współczynnika determinacji r².

Rozdziel aliquoty 300 µL mieszaniny reakcyjnej do probówek do mikrocentryfugi. Należy pamiętać o przygotowaniu reakcji kontrolnej bez enzymu; inkubować probówki przez jedną minutę w temperaturze 37 °C. W przypadku przeprowadzenia kilku reakcji, dodawać enzym do probówek w określonych odstępach czasu i natychmiast przekładać każdą probówkę z powrotem do bloku grzewczego o temperaturze 37 °C.

Po pięciu minutach dodać 50 µL 2 M chlorku hydroksyloaminy, wymieszać i inkubować przez pięć minut w temperaturze 60 °C. Następnie dodać 100 µL roztworu wywoływującego, wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej w celu wywołania koloru. Następnie odwirować próbki z prędkością 18 000 ×g przez jedną minutę.

Następnie należy zmierzyć absorbancję przy 540 nanometrach. Ilość obecnego acetylofosforanu wyznacza się poprzez porównanie z krzywą wzorcową acetylofosforanu. Dane można nanieść na wykres i dopasować do równania McKayla Cementin w celu wyznaczenia parametrów kinetycznych.

Niniejszy test określa zużycie substratu w postaci acetylfosforanu w celu pomiaru aktywności kinazy octanowej w kierunku powstawania octanu. Acetylfosforan pozostały po określonym czasie reakcji enzymatycznej jest przekształcany w acetyloksybutan, a następnie w kompleks wodorotlenku żelaza(III) z octanem, który ma czerwonawy kolor mierzalny przy 540 nanometrach. Typowa krzywa wzorcowa przedstawiająca zależność absorbancji przy 540 nanometrach od mikromoli acetylfosforanu ma nachylenie wynoszące 1,2332 jednostki absorbancji na mikromol acetylfosforanu.

Otrzymana wartość r kwadrat wynosząca 0,99 wskazuje, że dane dobrze pasują do równania liniowego przedstawionego tutaj. Analizę tę można wykorzystać do wyznaczenia KM dla acetylofosforanu dla różnych preparatów enzymatycznych. Przy stężeniu pięciu milimoli DP z różnymi stężeniami acetylofosforanu oczyszczona rekombinowana kinaza octanowa z methanol Sarina thermophilic wykazuje standardową kinetykę typu McKayla cementin dla każdego substratu, co skutkuje pozornym KM wynoszącym 0,27 plus lub minus 0,01 milimola acetylofosforanu.

W przeciwieństwie do standardowego testu sprzężonego, ten test bezpośredni pozwala na pomiar aktywności kinaz octanowych wykorzystujących substraty inne niż TP. Na przykład, w przypadku wykorzystania acetylofosforanu przez produkującą pirofosforan kinazę octanową z Entamoeba histolytica, w mieszaninie reakcyjnej w miejsce DP zastosowano fosforan sodu. Otrzymana krzywa wskazuje pozorną wartość KM wynoszącą 0,50 plus lub minus 0,006 millimolar acetylofosforanu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak bezpośrednio mierzyć aktywność kinazy octanowej poprzez oznaczenie ilości zużytego acetylofosforanu.

Kluczowym czynnikiem w uzyskaniu powtarzalnych wyników jest zachowanie spójności na każdym etapie, zwłaszcza podczas dodawania enzymu oraz w kroku mieszania.