Funkcjonalizacja i wzorowanie krzemu oraz germanu beztlenkowego metodą miękkiej litografii

Niniejszy protokół przedstawia sposób wzorcowania wolnego od tlenków krzemu i germanu przy użyciu reaktywnych organicznych monowarstw, z zastosowaniem wysoce wydajnego i operacyjnie prostego protokołu drukowania. Przedstawiono również selektywną funkcjonalizację wzorowanych podłoży zarówno za pomocą małych cząsteczek, jak i białek. Pierwszym krokiem protokołu jest kowalencyjna modyfikacja podłoży krzemowych lub germanowych za pomocą wysoce stabilnej pierwotnej monowarstwy organicznej.

Zabezpiecza to podstawowy interfejs nieorganiczno-organiczny przed degradacją reaktywną i uszkodzeniami oksydacyjnymi. Kowalencyjnie związana warstwa wierzchnia z estru hydroksymidu jest tworzona w celu zapewnienia utajonych funkcjonalności hydrolitycznych i reaktywnych. W drugim kroku jednorodne, dwuwarstwowe podłoża modyfikowane NHS są wzorowane metodą katalitycznego mikrodruku kontaktowego z użyciem stempla elastomerowego modyfikowanego kwasem sulfonowym; kontakt ze stemplem hydrolizuje grupy NHS, tworząc w ten sposób wzory chemicznie odróżnialnych grup aktywowanych NHS oraz wolnych kwasów karboksylowych. Następnie wzorowane podłoża są funkcjonalizowane małymi cząsteczkami organicznymi oraz białkami.

Krok ten polega najpierw na unieruchomieniu heterofunkcyjnych łączników zakończonych kwasem triacetylowym w regionach funkcjonalizowanych NHS, a następnie na selektywnym przyłączeniu białka zielonej fluorescencji z etykietą heksahistydynową. Podejście to pozwala na uzyskanie doskonałych wyników z wzorami różnej intensywności fluorescencji, które są bardzo wyraźne i zachowują wysoką stabilność integralności struktury po wielokrotnych modyfikacjach powierzchni.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest dokładność. Wzorzec jest w rzeczywistości kontrolowany przez precyzję samego stempla, a nie przez dyfuzję. Projekt został pierwotnie zainicjowany pomysłem, że techniki tworzenia wzorów opierające się na reakcji katalitycznej, w przeciwieństwie do zwykłego osadzania, muszą oferować liczne korzyści.

Po pierwsze, katalizatory nie ulegają zużyciu w reakcji i mogą być wykorzystywane wielokrotnie. W przeciwieństwie do tradycyjnego drukowania lub nanoszenia, gdzie istnieje ciągła potrzeba dostarczania nowych materiałów do wzorowania. W naszych wczesnych pracach przymocowaliśmy cząsteczkę katalizatora do końcówki AFM, a następnie przesuwaliśmy ją wzdłuż powierzchni w procesie seryjnym, podobnie jak w przypadku narzędzia skrawiającego, aby stworzyć wzór.

Jednak zastosowanie stempla elastomerowego stanowiło logiczne rozwinięcie w kierunku równoległych aplikacji produkcyjnych. Jednym z najważniejszych aspektów protokołu jest wykorzystanie dwuwarstwowego układu molekularnego. Układ ten pozwala nam zarówno na osadzanie, jak i funkcjonalizację podłoży organicznych oraz wolnych od tlenków.

W idealnym przypadku pierwotna warstwa SAM powinna zapewnić całkowite zakończenie wszystkich wystawionych na zewnątrz atomów powierzchni i utworzyć gęsto upakowany układ molekularny, który chroni powierzchnię zarówno przed utlenianiem, jak i degradacją. Wtórna warstwa wierzchnia powinna zawierać terminalne grupy funkcyjne, które mogą być dalej modyfikowane poprzez dodatkowe transformacje chemiczne. Istotnym ograniczeniem rozdzielczości tradycyjnego druku mikrokontaktowego jest dyfuzja wzoru i cząsteczek.

Nasze metody umożliwiają zajście reakcji chemicznej pomiędzy katalizatorem zmobilizowanym na trzonie a substratem przytwierdzonym do krzemu lub germanu. Dzięki tym właściwościom nasza technika pozwala na dokładniejszą replikację elementów o bardzo małych rozmiarach, rzędu 100 nanometrów. Ponieważ metoda ta tworzy wzory chemiczne, możliwe jest ich funkcjonalizowanie poprzez specyficzne reakcje z różnymi cząsteczkami biologicznymi i organicznymi.

Ta procedura wymaga użycia kilku niebezpiecznych substancji chemicznych, takich jak kwas fluorowodorowy, roztwór do nanochipów oraz pentachlorek fosforu. Podczas pracy z tymi odczynnikami ważne jest noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej i praca w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Najtrudniejszym elementem tego protokołu jest szybkie przeniesienie chlorowanych powierzchni do roztworu Grignarda.

Aby zapobiec ponownemu utworzeniu się warstwy tlenków, należy rozpocząć od przygotowania wafla krzemowego 11. Przeciąć go na podłoża o wymiarach jednego centymetra kwadratowego, odpylić podłoża, a następnie opłukać wodą i filtrowanym etanolem. Następnie usunąć wszelkie zanieczyszczenia organiczne, zanurzając podłoża krzemowe w szklanej korycie zawierającym nanos.

Roztwór do usuwania warstwy podgrzano do 75 °C. Odczekaj 15 minut, a następnie wypłucz. Oczyść każdy podłoże odfiltrowaną wodą dejonizowaną.

Każdy podłoże należy zanurzyć na pięć minut w 5%HF w celu usunięcia natywnej warstwy tlenku, a następnie wysuszyć pozbawiony tlenku krzem azotem. Aby uzyskać podłoże chlorowane, każdy pozbawiony tlenku kawałek krzemu należy natychmiast zanurzyć w fiolce scyntylacyjnej zawierającej dwa mililitry nasyconego pięciochlorku fosforu w chlorobenzenie. Po zakończeniu reakcji.

Pozostawć fiolki do ochłodzenia w temperaturze pokojowej. Przemyć każdą powierzchnię chlorobenzenem i osuszyć pod strumieniem przefiltrowanego azotu. Następnie umieścić każdą chlorowaną powierzchnię krzemową w fiolce ciśnieniowej zawierającej cztery mililitry chlorku magnezu w propanolu.

Inkubuj fiolki ciśnieniowe w temperaturze 130 °C przez 24 godziny. Po ostygnięciu fiolek ciśnieniowych do temperatury pokojowej, szybko przemyj każdą powierzchnię dichlorometanem i etanolem, a następnie wysusz w strumieniu filtrowanego azotu, analogicznie do przygotowania podłoża krzemowego. Potnij wafle germanowe na kwadraty o boku jednego centymetra, a następnie odpyl i przemyj wodą oraz filtrowanym etanolem.

Usuń zanieczyszczenia organiczne, zanurzając podłoża w naczyniu z acetonem na 20 minut. Następnie zanurz je w 10% roztworze HCL na 15 minut. Wysusz podłoża azotem i umieść każdą chlorowaną powierzchnię w fiolce ciśnieniowej zawierającej cztery mililitry chlorku magnezu w oktanu.

Inkubować fiolki w temperaturze 130 °C przez 48 godzin. Po inkubacji pozwolić fiolkom ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie szybko wypłukać każdy wafle dichlorometanem i etanolem. Osuszyć wafle pod strumieniem przefiltrowanego azotu.

Zacznij od naniosienia pipetą kilku kropli roztworu NHS Diaz na powierzchnię z grupami metylowymi. Pozostaw roztwór, aby rozprzestrzenił się po całej powierzchni. Umieść powierzchnie pod lampą UV na 30 minut.

Następnie nanieść na powierzchnię kolejne krople NHS Diaz i pozwolić reakcji przebiegać przez dodatkowe 30 minut. Przemyć powierzchnie zmodyfikowane NHS dichlorometanem i etanolem, a następnie wysuszyć je strumieniem filtrowanego azotu.

Następnie należy przeprowadzić funkcjonalizację małych cząsteczek. Na koniec przeanalizuj powierzchnie za pomocą XPS, aby określić skład pierwiastkowy. Rozpocznij przygotowanie stempla, mieszając etanosulfonian sodu w 10 ml 4 N roztworu HCl w dioksanie.

Mieszać roztwór w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Odfiltrować chlorek sodu za pomocą gęstego filtra szklanego, a następnie przez membranowy filtr strzykawkowy z PTFE o rozmiarze porów 0,2 mikrona. Następnie należy pobrać klarowny roztwór kwasu tumor capto etanosulfonowego w dioksanie i odparować dioksan pod zmniejszonym ciśnieniem.

Przeprowadź reakcję otrzymanego kwasu sulfonowego z dwoma mililitrami prepolimerowej mieszaniny akrylanu poliuretanu w temperaturze pokojowej, a następnie w próżni w temperaturze 50 °C. Należy upewnić się, że mieszanina została całkowicie oczyszczona z uwięzionych pęcherzyków powietrza, aby zapewnić prawidłową polimeryzację prepolimerowej mieszaniny. Ważne jest, aby nie przegrzać próbki podczas reakcji.

Dodaj kwas fonowy i odgazuj roztwór w próżni. Gdy roztwór stanie się lepki, wlej go na wzorcową formę krzemową i przykryj płaskim szkiełkiem podstawowym owiniętym parafilmem. Następnie utwardź formę, naświetlając ją światłem UV. Po polimeryzacji zdejmij szkiełko i parafilm, a następnie ostrożnie odklej stempel od wzorca, dotnij go do odpowiedniego rozmiaru i przemyj etanolem oraz wodą.

Następnie osuszyć go za pomocą przefiltrowanego azotu. Kolejny krok jest najważniejszym etapem protokołu. Umieścić stempel na powierzchni podłoża zmodyfikowanego NHS, nie stosując żadnego zewnętrznego obciążenia w celu ich przytrzymania.

Należy nie przesuwać stempla ani nie wywierać zbyt dużego nacisku. Po odczekaniu jednej minuty należy wypłukać podłoże i stempel wodą z etanolem, a następnie ponownie etanolem, po czym wysuszyć pod strumieniem przefiltrowanego azotu. Stemple należy przechowywać w temperaturze pokojowej w celu analizy uzyskanego wzoru.

Należy wykorzystać boczna mikroskopię sił atomowych w trybie kontaktowym oraz skaningową mikroskopię elektronową. Na tym etapie unieruchamiamy GFP na wzorowanej powierzchni krzemowej. W pierwszej kolejności modyfikujemy aktywny ester pochodną NTA, a następnie unieruchamiamy białko z tagiem HIIN na powierzchni poprzez chelatowanie niklem.

W tym kroku ważne jest utrzymanie badanej biomolekuły w odpowiedniej temperaturze, aby uniknąć niepożądanej degradacji. Aby przyłączyć białka do wzoru NHS na podłożu bifunkcyjnym, należy zanurzyć je w roztworze lizyny, kwasu nnn dia athetic i trietyloaminy. Po godzinie podłoża należy przepłukać wodą, a następnie etanolem.

Następnie inkubuj podłoża przez pięć minut w roztworze chelatującym siarczanu niklu. Potem opłucz podłoża wodą oraz buforem wiążącym, a następnie zanurz je w kąpieli z lodowatym roztworem GFP. Po godzinie opłucz podłoża tym samym buforem wiążącym, a następnie przemyj je w PBS.

Następnie należy przechowywać substraty w PBS w temperaturze 0°C przed analizą. Na koniec powierzchnie analizuje się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji obszarów zmodyfikowanych GFP. Do stworzenia wzorów chemoselektywnych na krzemie wolnym od tlenków zastosowano nanostrukturyzację litograficzną Soft B; w przypadku germanu reakcja między substratem funkcjonalizowanym NHS w stemplu z wzorem katalitycznym prowadzi do hydrolizy grup NHS w obszarach kontaktu konformacyjnego, co daje wzór na substracie funkcjonalnym zawierający regiony z aktywowanym przez NHS oraz wolnymi kwasami karboksylowymi.

Dzięki temu, że metoda ta nie opiera się na dyfuzji, rozdzielczość jest zbliżona do rozdzielczości fotolitografii, co widać na przykładzie struktur o rozmiarze 125 nanometrów. Struktury te zostały powtórzone w sposób jednolity na całej powierzchni podłoża krzemowego. Wymiary wydrukowanych struktur były identyczne z wymiarami w odpowiadającej im matrycy krzemowej oraz stemplu katalitycznym.

Co istotne, stempel katalityczny może być używany wielokrotnie bez utraty wydajności. Chemoselektywna funkcjonalizacja wzorowanych półprzewodników została przeprowadzona poprzez wykorzystanie różnic w reaktywności aktywowanych i wolnych kwasów karboksylowych. Najpierw do regionów funkcjonalizowanych NHS przymocowano heterobifunkcyjne łączniki zakończone kwasem niello trice, a następnie powstałą powierzchnię wzorowaną NHS wykorzystano jako szablon do selektywnego przyłączania tagu heksahistydynowego G-F-P-N-H-S.

Krzem został poddany funkcjonalizacji chemicznej cząsteczkami białek. Zastosowanie tej metody w mikroskopii fluorescencyjnej wykazało wyraźną różnicę w intensywności sygnału pomiędzy obszarami zmodyfikowanymi GFP a obszarami z wolnym kwasem karboksylowym poddanym hydrolizie. Rozmiar i kształt odwzorowanych struktur są zgodne zarówno dla powierzchni wzorowanych za pomocą NHS, jak i zmodyfikowanych GFP, co potwierdza wyjątkową stabilność powierzchni pasywowanych węglem oraz selektywność metody stemplowania.

Przedstawiony protokół jest formą druku mikrokontaktowego z użyciem tuszu, którą można zastosować uniwersalnie do każdego podłoża zdolnego do utrzymania prostych, dobrze uporządkowanych monowarstw. Ponieważ proces ten nie opiera się na przenoszeniu tuszu ze stempla na powierzchnię, wyeliminowano ograniczenia rozdzielczości dyfuzyjnej charakterystyczne dla tradycyjnego i reaktywnego druku mikrokontaktowego.

Umożliwia rutynowe wytwarzanie obiektów w skali nanometrycznej. Wprowadzenie pierwotnego, wysoce uporządkowanego systemu molekularnego zapewnia pełną ochronę leżącego poniżej półprzewodnika przed uszkodzeniami oksydacyjnymi. Tworzenie wybiórczych patentów CHE dostarcza specjalnie rozdzielonych punktów przyczepienia dla różnych cząsteczek biologicznych i organicznych.

Wykorzystując różną aktywność wolnych i aktywowanych grup carc, udało nam się unieruchomić nienaruszone białka histonowe na stworzonych wzorach. Metoda ta nie ogranicza się jednak wyłącznie do białek histonowych i może być stosowana do unieruchamiania innych biomolekuł, takich jak DNA i przeciwciała. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak modyfikować pasywowany krzem lub german za pomocą systemu molekularnego i wzoru katalitycznego.

Zmodyfikowane podłoża NHS. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować w czystym, wolnym od kurzu środowisku. Należy również stosować niezbędne środki ostrożności podczas pracy z materiałami niebezpiecznymi, takimi jak HF i nanos.Stripp.