Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

W tym artykule wideo opisujemy nowy protokół hydro-put dla zautomatyzowanej syntezy oligosacharydów w fazie ciekłej oraz funkcjonalizacji nanocząsteczek polianhydrydowych. W przypadku tych węglowodanowych czynników celujących, w pierwszej kolejności cząsteczki węglowodanów są syntetyzowane przy użyciu zautomatyzowanego systemu, który wykorzystuje syntezę w fazie ciekłej zamiast syntezatorów w fazie stałej. Następnie produkty pośrednie oligosacharydów są oczyszczane za pomocą ekstrakcji w fazie stałej typu florist, czyli FSPE.

Wytworzone cząsteczki węglowodanów charakteryzuje się za pomocą NMR, a następnie przyłącza się je do nanocząsteczek polianhydrydu poprzez konjugację karbo-IDE. Na koniec funkcjonalizowane węglowodanami nanocząsteczki charakteryzuje się za pomocą spektroskopii fotoelektronów emitowanych promieniami rentgenowskim oraz testu z kwasem fenylosulfonowym metodą hydro putt. Ostatecznie, wykorzystując opisaną tutaj metodologię hydro put, wyznaczono warunki reakcji optymalizujące morfologię nanocząsteczek oraz gęstość węglowodanów na powierzchni cząstek.

Główną zaletą tej metody w porównaniu do istniejących rozwiązań, takich jak synteza oligosacharydów na podłożu stałym, jest wykorzystanie znacznie mniejszej ilości bloków budulcowych. W tej metodzie zazwyczaj stosuje się od dwóch do trzech ekwiwalentów zamiast od 10 do 20 ekwiwalentów. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy wykazaliśmy skuteczność efektów powierzchniowych oraz funkcjonalizacji nanocząsteczek polihydroksylowych przy użyciu węglowodanów w celu celowania w receptory na komórkach antydentynowych. Następnie chcieliśmy zaprojektować system wysokoprzepustowy, który umożliwiłby nam przesiewanie wielu parametrów zaangażowanych w wytwarzanie i zastosowanie tych nowatorskich nośników.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ opracowanie zautomatyzowanych platform do wysokoprzepustowej syntezy oligosacharydów oraz ich przywiązania do cząsteczek polimerowych jest nowym obszarem badań, dla którego dostępna jest ograniczona dokumentacja. Przed zautomatyzowaną syntezą kwasu diano, odpowiednio chroniony donor cukru, zazwyczaj trichloroacetamid, oraz akceptor, głównie w alkoholu fluorowym, są syntetyzowane metodą tradycyjną i przygotowywane w chlorometanie; należy również przygotować trimetylosilan, trifluorometanosulfonian w chlorometanie, 80% methanol oraz 100% methanol. Należy upewnić się, że wilgotność względna w pomieszczeniu oraz w komorze automatyzacji nie przekracza 30%.

Wysoka wilgotność jest szkodliwa dla reakcji glikozylowania. Poniższe etapy są wykonywane przy użyciu platformy automatyzacyjnej. Pierwsze glikozylowanie przeprowadza się z użyciem donora i alkoholu florystycznego.

Po zakończeniu reakcji otrzymaną cząsteczkę cukru z etykietą florist jest oczyszczana za pomocą FSPE. Następnie tymczasowa grupa ochronna jest usuwana przy użyciu tlenku sodu i metanolu, a produkt ponownie poddawany jest oczyszczaniu metodą FSPE. Po tym etapie cukier z etykietą florist służy jako akceptor i jest sprzęgany z tym samym donorem w celu otrzymania disacharydu; uzyskany disacharyd jest oczyszczany za pomocą FSPE przed dalszymi etapami.

Umieść odczynniki, w tym promotor donor-akceptor, wodę z 80% metanolem, 100% metanol oraz metanolan sodu, na platformie robotycznej i uruchom program. Ramię robota pobierze donor, a następnie akceptor z fiolek i przeniesie je do fiolki reakcyjnej. Następnie mieszaninę donora i akceptora miesza się przez 30 minut.

Po upływie 30 minut ramię robotyczne przenosi katalityczny trifluorometanosulfonian trimetylsilyl do mieszaniny. Następnie roztwór jest mieszany przez kolejne 30 minut. Po zakończeniu mieszania program zostaje wstrzymany.

Pobrać alikwot 10 µL, aby sprawdzić za pomocą cienkowarstwowej chromatografii (TLC), czy reakcja dobiegła końca. Jeśli reakcja jest zakończona, cząsteczka akceptora nie będzie widoczna. Jeśli reakcja nie jest zakończona, akceptor na płycie TLC nadal będzie widoczny.

Jeśli tak się stanie, należy przerwać program, zresetować czas glikozylacji na około 30 minut i dodać nadmiar promotora trimetylosilofluorometanosulfonianu. Po zakończeniu reakcji należy przejść do następnego kroku. Po ukończeniu reakcji robot przenosi mieszaninę reakcyjną do kartridży FSPE zawierających modyfikowany żel krzemionkowy C9 F17 w celu przeprowadzenia oczyszczania.

Następnie wkłady przemywa się ośmioma mililitrami 80% methanol, a następnie ośmioma mililitrami 100% methanol. Aby wyeliminować frakcję nie-floris, przesącz zbiera się do fiolki, by uzyskać pożądany produkt znakowany floris. Jeśli wymagane jest dodatkowe oczyszczanie, należy zatrzymać robota i usunąć odpowiednie produkty reakcji.

W zależności od struktury, donory mogą być niezwykle nieaktywne, a część cząsteczek akceptora florystycznego może pozostać nawet po dodaniu odpowiedniej ilości promotora. W takim przypadku FSPE nie będzie wystarczająco wydajne do oczyszczania, dlatego po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać dodatkowe oczyszczanie za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Ramię robotyczne dozuje metanolan sodu do fiolki reakcyjnej. Następnie mieszanka jest mieszana przez dwie godziny na platformie robotycznej; jeśli analiza TLC wykaże, że reakcja nie została zakończona, czas inkubacji należy przedłużyć o około godzinę.

Po zakończeniu reakcji produkt jest oczyszczany za pomocą FSPE w taki sam sposób jak wcześniej. Następnie należy wyjąć produkt reakcji z robota i na blacie laboratoryjnym poddać go rozpuszczeniu w bezwodnym toluenie, a następnie odparowaniu w celu usunięcia resztek wody. Po wysuszeniu próbki należy ponownie umieścić ją w robocie i powtórzyć ten sam cykl, obejmujący glikozylację oraz oczyszczanie metodą FSPE.

Głęboka ochrona tymczasowej grupy ochronnej, a następnie glikozylacja, są powtarzane aż do uzyskania pożądanej długości łańcucha dla cząsteczki docelowej; aby usunąć grupę ochronną z produktu otrzymanego w procesie automatycznym, należy wyjąć fiolkę z robota. Końcowe etapy procedury wykorzystują wybuchowy wodór i muszą być przeprowadzone poza platformą automatyczną. Na blacie laboratoryjnym następuje ozonoliza wiązania podwójnego w znaczniku florystycznym, a następnie utlenianie powstałego aldehydu do kwasu karboksylowego.

Oczyszczono otrzymany produkt za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym na stole laboratoryjnym, wykorzystując mieszaninę 30% metanolu w dichlorometanie. Następnie, aby usunąć grupy benzoeterowe poprzez uwodornienie katalizowane palladem, produkt przepuszczono przez podkład z adsorbentu (satellite pad) w celu usunięcia palladu i otrzymania czystego produktu końcowego. Produkt w pełni scharakteryzowano za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Wysokoprzepływowa synteza polimerów i wytwarzanie nanocząstek są przeprowadzane zgodnie z protokołem opisanym przez Petersona i współpracowników. Jak wspomniano w towarzyszącym dokumencie, zautomatyzowane urządzenie do nanoszenia wykorzystywane do funkcjonalizacji cząstek składa się z trzech pomp ne 1000, robotycznego stołu zintegrowanego z dwoma siłownikami (jednym do ruchu w kierunku X i drugim do ruchu w kierunku Y) oraz drugiego stołu robotycznego z dwoma sąsiadującymi regałami składającymi się z trzech siłowników, po jednym dla każdego kierunku; pompy i łącznie pięć siłowników są połączone szeregowo. Siłowniki i pompy są sterowane za pomocą komputera z wykorzystaniem oprogramowania LabVIEW.

Systemy kopolimerowe wykorzystywane do wytwarzania cząsteczek opierają się na kwasie SEBA lub SA oraz 1,6-bis(p-karboksyfenoksy)heksanie lub CPH i 1,8-bis(p-karboksyfenoksy)-3,6-dioksanie lub CP Teeg. Po etapie wytwarzania nanocząsteczek umieść statyw zawierający probówki do wirowania o pojemności 1,7 ml z biblioteką nanocząsteczek na stole siłownika liniowego w celu przyłączenia węglowodanów do powierzchni cząsteczek polianhydrydów; przeprowadzana jest reakcja sprzęgania kwasu karboksylowego składająca się z dwóch następujących po sobie etapów. W przypadku pierwszej reakcji napełnij strzykawkę w programowalnej pompie strzykawkowej wodnym roztworem EDC i etylenodiaminy w stężeniach odpowiednio 2 mg per mg nanocząsteczek oraz 0,6 mg per mg nanocząsteczek.

Napełnij drugą strzykawkę w programowalnej pompie strzykawkowej roztworem wodnym NHSA o stężeniu 2,5 mg na mg cząsteczek, tak aby całkowita ilość wynosiła 12 równoważników na próbkę nanocząstek. Następnie, korzystając z programu LabVIEW, zaprogramuj robota tak, aby naniósł zawiesiny reagentów do biblioteki nanocząsteczek. Siłowniki robota przesuną następnie uchwyt probówek w odpowiednie miejsce na platformie w celu dozowania roztworów, EDC oraz NHS.

Aktywuj grupy kwasu karboksylowego na powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu, aby umożliwić sprzęganie średnie. Następnie zanurz sondę sonikacyjną w każdej probówce i poddaj każdą próbkę sonikacji przez 30 sekund przy częstotliwości 40 hertz. Przed przejściem do następnej próbki oczyść sondę acetonem.

Po nasyceniu wszystkich próbek uchwyt do probówek zostaje odłączony od platformy robotycznej. Inkubuj zawiesiny nanocząstek przez dziewięć godzin przy stałym obrotowaniu w temperaturze 4 °C. Czas trwania pierwszej i drugiej reakcji można zmienić, aby dostosować końcowe stężenie sacharydu.

Po zakończeniu reakcji odwiruj probówki z prędkością 12 000 ×g przez pięć minut. W warunkach chłodniczych przenieś je z powrotem do stacji robotycznej. Przymocuj uchwyt na probówki do ramienia robota i napełnij drugą strzykawkę w platformie robotycznej.

W przypadku użycia zimnej wody pierwsza strzykawka powinna pozostać pusta. Uruchom robota. Nadpływ z każdej probówki zostaje wciągnięty do pustej strzykawki, a druga pompa dozuje zimną wodę do probówek.

Ten etap przeprowadza się w celu usunięcia wszystkich niereagujących reagentów z zawiesin nanocząsteczek. Następnie homogenizuje się zawiesinę nanocząsteczek poprzez sonikację, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Potem probówki wiruje się w wirówce z przyspieszeniem 12 000 ×g przez pięć minut.

Przeprowadź drugie płukanie zimną wodą przy użyciu urządzenia robotycznego. Dla drugiej partii reakcji wprowadź do pierwszej pompy 12 równoważników EDC na próbkę nanocząsteczki, a do drugiej pompy 12 równoważników NHS na próbkę nanocząsteczki. Uruchom platformę robotyczną, aby dozować odpowiednie objętości do probówek zawierających nanocząsteczki. Obecność EDC i NHS umożliwi utworzenie wiązania amidowego pomiędzy grupami aminowymi etylenoditaminy, która jest już przyłączona do powierzchni nanocząsteczek, a grupą kwasu karboksylowego chronionego cukru.

Po zakończeniu procesu osadzania należy załadować 10 równoważników konkretnego sacharydu. W tym przypadku wykorzystano laktozę oraz kwas glikolowy jako kontrolę w dwóch dostępnych pompach. Każdy sacharyd jest dozowany do probówek w zależności od pożądanej funkcjonalizacji w każdej z nich, co jest wcześniej zaprogramowane w oprogramowaniu LabVIEW, służącym do sterowania siłownikami i funkcjami pomp dla konkretnej reakcji. W niniejszym badaniu, w celu przyłączenia węglowodanów, kwas glikolowy jest stosowany jako kontrolny łącznik, ponieważ głęboko chronione sacharydy mają już kowalencyjnie przyłączoną tę cząsteczkę, co umożliwia dalsze przytwierdzenie do powierzchni nanocząsteczki.

Zawiesiny nanocząstek homogenizuje się poprzez sonikację, analogicznie jak wcześniej, a następnie inkubuje przez dziewięć godzin przy stałej rotacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji zawiesiny nanocząstek należy przemyć poprzez wirowanie z usunięciem nadsączu, a następnie resuspender osad w zimnej wodzie i poddać sonikacji. Probówki zawierające obecnie bibliotekę funkcjonalizowanych nanocząstek umieszcza się w komorze próżniowej w celu osuszenia przez co najmniej dwie godziny. Funkcjonalizowane nanocząstki charakteryzuje się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła oraz innych metod w celu oceny składu powierzchni, stężenia, wielkości cząstek, rozkładu wielkości oraz ładunku powierzchniowego.

W pełni chroniony produkt diano przedstawiony tutaj został zsyntetyzowany przy użyciu platformy automatyzacyjnej. Zsyntetyzowany związek został scharakteryzowany metodą protonowego NMR w spektrometrze VXR 400 megahertz. Przy zastosowaniu CDC 13 jako rozpuszczalnika, powstanie produktu można potwierdzić na podstawie obecności kilku charakterystycznych sygnałów.

Na widmie NMR protonowego, cztery protony w zakresie od 1,79 do 2,21 oraz dwa protony przy 3,38 pochodzą z etykiety florystycznej. Pik singletowy przy 2,16 odpowiada pikowi octanowemu, a piki przy 4,94 i 5,11 to protony anomeryczne; służą one do oceny wpływu czasu reakcji na końcową morfologię nanocząsteczek oraz stopień przyłączenia cukrów. Nanocząsteczki funkcjonalizowano przy zwiększaniu czasu reakcji, jak pokazano tutaj; stężenie diano na powierzchni nanocząsteczek 50 50 CPT CPH wzrastało wraz z całkowitym czasem reakcji i osiągnęło maksimum po 18 godzinach.

Nanocząsteczki funkcjonalizowane przez całkowity czas reakcji wynoszący 24 godziny zostały następnie wykorzystane do oceny ich zdolności do celowania w receptory lektynowe typu C (CLR) na pochodzących z szpiku kostnego myszy komórkach dendrytycznych przy użyciu cytometrii przepływowej, jak pokazano tutaj. Po stymulacji nanocząsteczkami niefunkcjonalizowanymi, a także funkcjonalizowanymi laktozą i dermanem, zaobserwowano zwiększoną ekspresję DC-SIGN oraz receptora mannozowego należącego do receptorów lektynowych typu C. Wskazuje to na skuteczne celowanie.

Jednakże cząsteczki funkcjonalizowane Diano wykazały wyższy poziom ekspresji, co wskazuje na swoistość tego liganda względem badanych receptorów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania wysokoprzepustowej zautomatyzowanej syntezy oligosacharydów, jak również funkcjonalizacji nanocząsteczek polimerowych. Wykorzystując te węglowodany jako czynniki celujące, po opanowaniu syntezy chronionego cukru donor-akceptor, montaż aparatury można przeprowadzić w ciągu 24 do 48 godzin.

Oczywiście czas trwania zależy od rozmiaru biblioteki oraz czasu funkcjonalizacji. Stosując tę metodę, należy pamiętać, że warunki reakcji funkcjonalizacji biodegradowalnych cząsteczek hydrożelowych można optymalizować w zależności od chemii nanocząsteczek. Postępując zgodnie z tą procedurą, można syntetyzować różne struktury węglowodanów w celu celowania w różne receptory komórkowe, aby wpłynąć na efekt immunologiczny.