Detekcja i izolacja krążących komórek czerniaka z wykorzystaniem fotoakustycznej cytometrii przepływowej

Celem następnego eksperymentu jest wykrycie nowotworu przed powstaniem przerzutów. Osiąga się to poprzez pobranie i rozdzielenie próbek krwi od pacjentów z czerniakiem w czwartym stadium. W drugim kroku krew wprowadza się do fotoakustycznej komory przepływowej, która umożliwia detekcję i izolację komórek czerniaka.

Następnie wykonuje się obrazowanie wychwyconych komórek, aby potwierdzić obecność wykrytego czerniaka. Wyniki wykazują zdolność systemu do dokładnego i szybkiego wykrywania oraz izolowania komórek czerniaka w oparciu o formy fal fotoakustycznych i techniki obrazowania komórek. Główną zaletą naszej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wykrywania krążących komórek czerniaka, takimi jak R-T-P-C-R, biomagnetyczne sortowanie komórek oraz inne metody, jest to, że nasza metoda nie wymaga znakowania i pozwala na wychwytywanie krążących komórek czerniaka bez modyfikowania ich powierzchni ani przytwierdzania ich do podłoża.

Aby przygotować próbkę do wykrywania przerzutów nowotworowych, należy rozpocząć od pobrania około 10 ml krwi pełnej od pacjenta z czwartym stadium raka. Próbki w dwóch probówkach typu vacutainer o pojemności 5 ml należy wirować przez 10 minut. Przy prędkości 3000 RPM próbka krwi rozdzieli się na trzy różne warstwy. Warstwę dolną stanowią erytrocyty.

Warstwa środkowa, nazywana również warstwą leukocytarną (buffy coat), zawiera leukocyty i komórki czerniaka, a warstwa górna zawiera osocze i płytki krwi. Usuń jak najwięcej osocza, nie naruszając warstwy leukocytarnej. Dodaj 250 µL OptiPrep 1077 do probówek typu Eppendorf o pojemności 2 mL.

Za pomocą dziewięciocalowej pipety Pasteura pobierz pozostałą plazmę, całą warstwę białkową (buffy coat) oraz górną warstwę erytrocytów. Należy upewnić się, że pobrana objętość wynosi mniej niż 500 µL. Przenieś roztwór do wcześniej przygotowanych probówek wind Trobe.

Krew ponownie się rozdzieli, lecz tym razem erytrocyty zostaną oddzielone przez hispę, co umożliwi łatwe wyodrębnienie warstwy leukocytarnej (Buffy coat). Za pomocą dziewięciocalowej pipety Pesa należy wyizolować całą warstwę leukocytarną i przenieść ją do probówki eend orph o pojemności 2 ml. Następnie należy zawiesić ją w 1,5 ml PBS z 2% v/v między 20.

Aby zbudować komorę przepływową, należy zacząć od akrylowego cylindra o długości 8 mm, średnicy zewnętrznej 20 mm i średnicy wewnętrznej 17 mm. Następnie należy wywiercić w bocznej ściance cylindra trzy otwory o średnicy 5 mm, rozmieszczone pod kątem 90 stopni względem siebie. Na koniec należy odciąć trzy kawałki rurki polimerowej i umieścić je w wywierconych otworach.

Naciągnij parafilm na dno pierścienia akrylowego, aby stworzyć wodoszczelną uszczelkę. Parafilm wraz z pierścieniem akrylowym utworzy płytką miseczkę, która pomieści roztwór akrylamidu służący do stworzenia komory przepływowej. Przeciągnij drut o średnicy 1,6 millimeter przez kawałki rurek znajdujące się naprzeciw siebie, upewniając się, że przez środek pierścienia, w stronę trzeciego kawałka rurki, widoczny jest tylko drut.

Wprowadź drut o średnicy 1,6 mm i ustaw rurkę w odległości 1 mm od zawieszonego drutu. Druty te zapobiegają przedostawaniu się akryloamidu do rurki. Przygotuj 5 mL akryloamidu.

Następnie szybko wlej mieszaninę do akrylowego pierścienia, wypełniając go do pełna. Po kilku sekundach roztwór ulegnie żelowaniu. Aby utworzyć formę komory przepływowej, ostrożnie wyciągnij druty, dbając o to, by nie zakłócić struktury żelu akryloamidowego, pozostawiając cylindryczną drogę przepływu oraz miejsce na rozmieszczenie światłowodu skupionego na tej drodze.

Komora przepływowa jest teraz gotowa do użycia z zastosowaniem żelu ultradźwiękowego dla zapewnienia sprzężenia akustycznego. Połącz piezoelektryczny przetwornik akustyczny z polifluorku winylidenu z komorą przepływową bezpośrednio nad ścieżką przepływu. Za pomocą złącza bagnetowego lub kabla BNC podłącz przetwornik do wejścia odbiornika szerokopasmowego.

Podłącz wyjście filtra do oscyloskopu, aby uruchomić wyzwalanie oscyloskopu. Umieść fotodiodę w pobliżu przetwornika i podłącz ją do oscyloskopu za pomocą kabla B NNC. Wysuń cienką rurkę komory przepływowej, aż utworzy się niewielka kieszeń powietrzna, a następnie połącz ją z przetwornikiem.

Następnie należy włożyć światłowód i wypełnić komorę wodą, aby zredukować sygnały z interfejsu i zwiększyć ilość światła laserowego kierowanego na ścieżkę przepływu. Ze względu na aperturę numeryczną światłowodu i krótką odległość do ścieżki przepływu, laser będzie naświetlał w danym momencie tylko jedną porcję próbki, co gwarantuje, że próbka znajdująca się bezpośrednio przed laserem jest tą samą próbką, która generuje sygnały fotoakustyczne.

Następnie podłącz złączkę T do jednego ramienia komory przepływowej oraz dwie pompy strzykawkowe do pozostałych odgałęzień złączki. Jedna strzykawka powinna zawierać powietrze, a druga wcześniej przygotowaną zawiesinę komórek. Następnie uruchom obie pompy strzykawkowe.

Gdy dwa dopuszczalne płyny dotrą do złącza T, zostaną one podzielone na jednorodne segmenty i przepłyną obok przetwornika. Naświetl płynącą próbkę nanosekundowym laserem impulsowym, aby wywołać fale fotoakustyczne w komórkach czerniaka. Ponieważ melanina jest szerokopasmowym absorberem optycznym, można zastosować dowolną długość fali lasera z zakresu widzialnego.

Sygnał pojawiający się na oscyloskopie, gdy śluzowiec znajduje się nad przetwornikiem, wskazuje, że zawiera on czerniaka. Należy go śledzić w systemie przed zrzuceniem do fiolki zbierającej. Aby przygotować próbki do immunocytochemii, należy umieścić szkiełka przedmiotowe w lejkach do cytocentryfugi, a następnie załadować je do cytocentryfugi i wirować, aby pomóc przechwyconym komórkom przytwierdzić się do szkiełek przedmiotowych.

Do każdego lejka wlej 100 µL 1%BSA w PBS. Następnie wiruj z prędkością 600 RPM przez trzy minuty. Po wirowaniu dodaj próbki komórek do lejków CyTOF, a następnie ponownie wiruj z prędkością 600 RPM przez trzy minuty.

Spryskaj preparaty fiksatywem na bazie etanolu. Następnie przemyj preparaty w PBS dwukrotnie przez 10 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązania. Inkubuj każdy preparat w mieszaninie 10 µL surowicy koziej i 90 µL PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji odlać ciecz z szkiełek i dodać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego. Każde szkiełko powinno zawierać 1%rabbit mark, jedno 1%mouse CD 45 oraz 10%goat serum w PBS; inkubować przez jedną godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć szkiełka w PBS przez 10 minut, powtarzając czynność trzy razy.

Następnie inkubować preparaty z odpowiednimi fluorescencyjnymi przeciwciałami wtórnymi w ciemności przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie zlać roztwór z szkiełek. Potem przemyć je w PBS przez pięć minut, powtarzając czynność trzykrotnie; aby zabarwić jądra, inkubować komórki z 0,1 µg/mL DPI przez jedną minutę. Następnie zlać roztwór z szkiełek i przemyć w PBS.

Na koniec, używając medium montażowego na bazie żywicy, przymocuj szkiełko nakrywkowe nad próbką komórek, uszczelnij szkiełko bezbarwnym lakierem do paznokci i wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Formy fal fotoakustycznych z leukocytów i komórek czerniaka przedstawiono tutaj po lewej stronie. Leukocyty, nie posiadając naturalnej pigmentacji, nie generują fal fotoakustycznych i przejawiają się jako płaska linia szumu elektronicznego po prawej stronie.

Jednakże pigmentowane komórki czerniaka generują silną falę fotoakustyczną. Po immunocytochemicznym barwieniu chemicznym hodowane komórki czerniaka wykazują plamiste sygnały w kolorze niebieskim; jedna z zaznaczonych komórek została wyróżniona zieloną nakładką na obrazach DPI, a jedna z nich została oznaczona CD 45 jako wskaźnik leukocytów. Rysunek ten przedstawia komórki czerniaka pośród kilku białych krwinek po zakończeniu procesu rozwoju.

Nasza technika utoruje drogę badaczom w dziedzinie wykrywania nowotworów do zgłębiania zjawiska przerzutowania, aby zarówno usprawnić diagnostykę raka, jak i ostatecznie powstrzymać jego śmiertelne rozprzestrzenianie się.