Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie metody znanej jako tandemowe oczyszczanie powinowactwa (Tandem affinity purification) do izolacji białek wiążących. Witajcie, jestem dLAN Bailey z sekcji wirusologii w Imperial College London. W naszym laboratorium badamy interakcje między wirusami a gospodarzami dla różnych przedstawicieli rodzin wirusów.

Identyfikacja białek oddziałujących z innymi białkami komórkowymi lub wirusowymi stanowi doskonały punkt wyjścia do badania interakcji między wirusem a gospodarzem podczas infekcji. W tym filmie wyjaśnię jedną z metod stosowanych w naszym laboratorium: tandemową oczyszczanie białek, czyli tagowanie TAP. Tag TAP użyty w niniejszym badaniu to tag N-terminalny składający się z dwóch jednostek białka G oraz peptydu wiążącego streptawidynę.

Są one oddzielone sekwencją cięcia proteazy TEV, która umożliwia specyficzne eluowanie białka przynęty. W tym przykładzie mysi EIF4E znajduje się na końcu C tego konstruktu fuzyjnego. Protokół znakowania TAP jest procedurą składającą się z sześciu kroków.

Po transfekcji i wygenerowaniu linii komórkowych, komórki są indukowane do ekspresji białka z tagiem przed poddaniem ich działaniu łagodnego buforu lizującego. W celu oczyszczenia białka przynęci oraz wszelkich potencjalnych partnerów oddziałujących w celu wygenerowania linii komórkowych, stosuje się dwa etapy oczyszczania powinowactwa i dwa specyficzne roztwory. Komórki HEC 2 93 powinny zostać poddane transfekcji wektorem ekspresyjnym P met cztery.

Komórki z białkiem przynęty z tagiem TAP są następnie selekcjonowane przy użyciu 100 µg/ml hygromycyny B. Ponieważ plazmid jest utrzymywany episomalnie, nie ma potrzeby izolowania konkretnych klonów. 10 konfluencyjnych kolb komórek poddaje się indukcji poprzez traktowanie 10 µM chlorkiem kadmu przez 16 godzin, a następnie komórki są zeskrobane do pożywki. Zawieszone komórki przenosi się następnie do probówek 15 ml, a komórki są pelletowane poprzez wirowanie.

Komórki te są następnie płukane trzykrotnie lodowatym PBS, a na koniec poddawane wirowaniu w celu otrzymania osadu. Krok drugi: lizę komórek przeprowadza się w 5 ml zimnego buforu do lizy poprzez wielokrotne pipetowanie, po czym próbki pozostawia się na lodzie przez 5 minut. Aby zapewnić wydajną lizę, komórki są następnie przepuszczane przez strzykawkę z wąską, tępą igłą i poddawane cyklowi zamrażania i rozmrażania.

Uzyskany lizat rozdzielono do probówek 1,5 ml, a następnie usunięto nieprzelyzowane komórki i zanieczyszczenia poprzez wirowanie. Należy zauważyć, że po tym etapie wirowania rozmiar osadu jest znacznie mniejszy. Nadnadkładami z lizatów połączono w probówce Falcon 15 ml i przepuszczono przez filtr 0,45 mikrometra w celu usunięcia wszelkich pozostałych zanieczyszczeń.

Należy pobrać 50 µL alikwoty tego lizatu do późniejszej analizy. Próbka ta jest określana jako próbka jeden. Krok trzeci, wiązanie z przeciwciałami anty-IgG królika.

Na tym etapie protokołu znaczniki białka G są immunoprecypitowane za pomocą kulek agarozy z przeciwciałami króliczymi IgG. Aby nanieść kulki agarozy, należy odciąć końcówkę tipa. Pomaga to uniknąć uszkodzenia kulek.

Delikatnie resuspenduj roztwór rabbit IgG aro, obracając butelkę, a następnie przenieś aros do probówki 15 ml. Przemyj aros trzykrotnie w schłodzonym buforze lizującym, stosując wirowanie z niską prędkością w celu oczyszczenia kulek na każdym etapie. Po odwirowaniu powinny być widoczne osady kulek rabbit IgG.

Po każdym kroku ostrożnie usuń bufor, nie naruszając osadzenia kulek. Po zakończeniu ostatniego płukania dodaj przefiltrowany i sklarowany lizat do upakowanych kulek i inkubuj przez trzy godziny lub przez noc. Zaleca się prowadzenie inkubacji w temperaturze 4°C przy użyciu mieszadła rotacyjnego.

Po immunoprecypitacji odwiruj kuleczki agarozy i pobierz nadsącz do późniejszej analizy. W razie potrzeby można użyć końcówki o małej średnicy, aby usunąć pozostałą ciecz z probówki. Nadsącz ten stanowi próbkę dwa krok cztery trawienie proteazą TEV.

W tym kroku przynęta zostaje odcięta od znaczników białka G. Etap ten umożliwia specyficzne odcięcie białka przynęty, co w praktyce stanowi krok elucji z immunoprecypitacji przy użyciu IgG króliczego. Przygotować mieszaninę do trawienia TEV i dodać ją do kulek za pomocą końcówki pipety z odciętym końcem, przenieść tę mieszaninę do silikonizowanej probówki do mikrowirówki i odwrócić, aby zawiesić kulki przed inkubacją przez noc w temperaturze 4°C, a następnie pobrać alikvot z tej reakcji trawienia TEV do analizy.

To jest przykład trzeci. Inkubacja przez noc na mieszalniku rotacyjnym powinna pozwolić na niemal całkowite dobiegnięcie reakcji TEV. Krok piąty: wiązanie w celu unieruchomienia kulek z streptawidyną.

W tym kroku przynęta Cleve oraz wszelkie potencjalne partnery wiążące są oczyszczane z roztworu metodą powinowactwa. W pierwszej kolejności odwiruj mieszaninę z reakcji cięcia TEV zawierającą kulki aros z IgG królika. Aby uzyskać osad z kulek aros, pobierz odpowiednią ilość klarownego supernatantu do analizy.

To jest próbka czwarta. Ostrożnie przenieś cały pozostały nadsącz zawierający białko przynętę do nowej probówki. Ponownie użyj końcówki z wąskim otworem.

Użyj końcówek z filtrem, aby usunąć cały możliwy nadsącz. Zachowaj kulki aros z przeciwciałami królika IgG do późniejszej analizy. Jest to próbka piąta.

Aby zapobiec uszkodzeniu kulek strep adin, odetnij końcówkę z tipa do pipety. Delikatnie resuspenduj kulki i przenieś aliquot do probówki sylikonizowanej. Przemyj kulki strep having za pomocą buforu S, oczyszczając je poprzez wirowanie z niską prędkością.

Po każdym praniu. Po każdym praniu ostrożnie usuń bufor. Kulki streptavidynowe są bardzo małe i mogą zostać łatwo przemieszczone, nawet przy użyciu precyzyjnych narzędzi.

Przygotowanie próbek. Po przemyciu kulek strept adin dodaj nadsącz z reakcji cięcia TEV do tych kulek i inkubuj reakcję przez trzy godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C, używając mieszadła obrotowego.

Po inkubacji odwiruj próbkę, aby osadzić kulki streptawidyna-haewina, a następnie usuń nadsącz. Jest to próbka szósta. Do odnotowania.

Białko przynęta jest teraz związane z pozostałymi kuleczkami w probówce. Przemyj kuleczki streptawidynowe zawierające białko przynętę buforem do lizy. Aby usunąć wszelkie dodatkowe zanieczyszczające białka, odlej pozostały roztwór piorący z kuleczek i pozostaw je na lodzie.

Krok szósty, elucja biotyną. Na tym etapie do kulek z streptawidyną dodaje się biotynę. Oddziaływanie między biotyną a kulkami z streptawidyną wypiera przynętę, która powraca do roztworu.

Dodaj roztwór biotyny bezpośrednio do kulek i odwróć probówkę, aby wymieszać. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 4 °C przez trzy godziny lub przez noc, używając wirówki z funkcją mieszania rotacyjnego, a następnie ostrożnie przelej mieszaninę biotyny i aerozolu do nowej probówki. Jest to końcowy EIT, określany jako próbka siedem.

Pozostałe koraliki strept havein stanowią próbkę ósmą. Ze względu na niskie stężenie białka, ten końcowy eluat musi zostać zagęszczony przed analizą. Osiąga się to przy użyciu kolumn wirowych z niskim odcięciem masy cząsteczkowej, redukując objętość poprzez wirowanie i regularnie monitorując ten proces.

Tę skoncentrowaną próbkę można podzielić i przeanalizować na żelach SDS-PAGE za pomocą barwienia kumasylem lub srebrem. Jeśli próbki mają być analizowane za pomocą spektrometrii mas, zalecamy stosowanie gotowych żeli komercyjnych. Następnie można wyciąć poszczególne prążki i zidentyfikować białka za pomocą spektrometrii mas.

W tym przypadku przynętą była mysia przeciwciała EIF przeciwko białku E. Zaletą systemu TAP jest możliwość ekspresji białka zainteresowania w konkretnej linii komórkowej, a w zależności od wybranej linii, system ten pozwala również na ekspresję białka na stosunkowo niskim poziomie, jeśli tak zdecydujesz. Ponieważ wszystkie modyfikacje potranslacyjne oraz lokalizacja zostają zachowane, często można w ten sposób oczyścić natywny kompleks.