Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zilustrowanie zastosowania glikozydaz do enzymatycznego deglikozylacji oraz analizy glikozylacji typu N i O na modelowym glikoproteinie. Osiąga się to poprzez traktowanie glikoproteiny enzymem PGA's F lub mieszaniną do deglikozylacji białek. Ponadto mieszanina do deglikozylacji białek została uzupełniona o mieszaninę dodatkowych egzo-glikozydaz, które czasami pomagają w usunięciu cukrówOtherwise opornych na hydrolizę.

Metodę tę ilustrujemy na przykładzie modelowej glikoproteiny – rekombinowanej ludzkiej beta-podjednostki gonadotropiny kosmórkowej (HCG beta), następnie przeprowadzając elektroforezę SDS-PAGE, po której następuje barwienie błękitem Coomassie oraz specyficzne barwienie cukrów metodą Pro Q Emerald 300 w celu analizy glikozylacji. Uzyskane wyniki dla próbki HCG beta wykazują, że HCG beta jest heterogennie glikozylowana i zawiera wiele glikoform, co wynika z różnic w migracji białka z traktowaniem glikozydazą i bez niego, a także ze zmniejszenia sygnału w barwieniu ProQ w miarę sukcesywnego usuwania glikanów.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza spektrometrią mas, jest jej prostota, wykorzystanie powszechnego wyposażenia laboratoryjnego oraz odpowiedniość dla początkujących glikobiologów. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie glikobiologii, na przykład czy badane białko jest glikozylowane. Aby rozpocząć enzymatyczną deglikozylację, należy rozmrozić bufory dostarczone w zestawie do deglikozylacji białek.

Dokładnie wymieszać zawartość probówek i przechowywać w temperaturze pokojowej. Probowki zawierające enzymy umieścić w lodu, zawartość fiolki HCG beta rozpuścić w 600 µL wody destylowanej i utrzymywać w lodu. Po przygotowaniu 1 mL buforu 1X G7 poprzez rozcieńczenie roztworu stokowego 10X w wodzie destylowanej, użyć 25 µL buforu do rozcieńczenia 0,5 µL PGA's f.

Przygotuj mieszaninę exo glikozydaz, łącząc po dwa mikrolitry każdej z czterech exo glikozydaz. Następnie do siedmiu ponumerowanych probówek PCR dodaj HCG beta oraz 10x bufor denaturujący glikoprotein zgodnie z instrukcją w protokole pisemnym, zamknij probówki i delikatnie wymieszaj. Zdenaturuj białka w termocyklerze, inkubując przez 10 minut w temperaturze 94 °C, a następnie w temperaturze 4 °C. Po wyjęciu probówek z termocyklera odwiruj je w wirówce, aby usunąć widoczną kondensację. Do każdej probówki z reakcją dodaj pozostałe odczynniki zgodnie z protokołem pisemnym. Zamknij probówki PCR za pomocą nowych zakrętek.

Następnie wymieszaj zawartość probówek, delikatnie stukując je cztery razy po odwirowaniu zawartości, umieść probówki w termocyklerze i inkubuj w temperaturze 37 °C przez cztery godziny. Następnie schłodź próbki do temperatury 4 °C. Aby przygotować elektroforezę SDS-PAGE, sporządź świeży 3x redukcyjny bufor do nakładania próbek SDS.

Do każdej próbki z DTT należy dodać 12,5 µL przygotowanego trzykrotnego redukującego buforu do ładowania SDS, zamknąć probówki nowymi nakrętkami i delikatnie nimi potrząsnąć, aby wymieszać zawartość. Inkubować probówki w termocyklerze w temperaturze 94 °C przez pięć minut, a następnie schłodzić do 4 °C. Po inkubacji na żel tri-glicynowy 10–20% nałożyć 30 µL każdej próbki oraz 10 µL markera białek, zachowując pozostałą część każdej próbki.

Przeprowadź elektroforezę żelu przy napięciu 130 V, aż front barwnika dotrze do dolnej części żelu. Po zakończeniu elektroforezy wyjmij żel z formy i umieść go w małym plastikowym pojemniku z wystarczającą ilością barwnika Coomassie Blue, aby całkowicie go przykryć. Barw żel przez jedną godzinę przy delikatnym mieszaniu. Po zakończeniu barwienia żelu.

Przemyć trzy razy przez 30 minut. W 50 mililitrach roztworu detain zarejestrować obrazy, używając transluminatora światła białego lub skanera. Alternatywnie żel można wysuszyć pomiędzy arkuszami celofanu.

W jednej ramce, podczas prowadzenia elektroforezy, rozdziel pozostałe części każdej próbki oraz marker białek na żelu 10-20% Tri-glicynowym. Rozpuść odczynnik ProQ emerald w DMF i przygotuj roztwory stokowe do utrwalania, przemywania oraz utleniania zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Po zakończeniu elektroforezy wyjmij żel z formy i umieść go w plastikowym pojemniku.

Utrwal żel, dodając 100 milliliters przygotowanego roztworu utrwalającego. Pozostaw żel przez noc w temperaturze pokojowej, a następnego dnia poddaj go delikatnemu mieszaniu. Przemyj żel 100 milliliters przygotowanego roztworu piorącego przez 10 do 20 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu, powtarzając czynność płukania drugi raz ze świeżą porcją roztworu piorącego.

Następnie utlenij węglowodany, inkubując żel przy łagodnym mieszaniu przez 30 minut w 25 mililitrach przygotowanego roztworu utleniającego, a po inkubacji wykonaj dwa dodatkowe płukania żelu. Przygotuj świeżą barwnik ProQ emerald 300, dodając 500 mikrolitrów roztworu odczynnika ProQ Emerald 300 do 25 mililitrów buforu do barwienia dostarczonego w zestawie. Wybarw żel, inkubując go w przygotowanym barwniku w ciemności przy łagodnym mieszaniu przez 90 do 120 minut.

Powtórz dwa etapy płukania zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie zarejestruj obrazy przy użyciu transiluminatora UV przy 300 nanometrach. W końcowym kroku porównaj obrazy żelu barwionego kumasi z obrazami żelu barwionego ProQ emerald.

Zmiany w migracji białka po enzymatycznej deglikozylacji są widoczne przy porównaniu próbki kontrolnej z próbką poddaną działaniu PGA's F. W celu usunięcia glikanów typu N stosuje się mieszaninę do deglikozylacji, a w celu usunięcia glikanów typu N i O – odpowiednią obróbkę; po trawieniu dodatkową glikozydazą nie obserwuje się dalszego zmniejszenia rozmiaru. Oprócz zmiany masy, pasma stają się ostrzejsze wraz z usuwaniem glikanów.

Prążek znajdujący się poniżej markera 17 kilodalton prawdopodobnie reprezentuje w pełni deglikozylowany polipeptyd beta HCG. Ścieżki od piątej do siódmej pokazują prążki odpowiadające Glyco. Inne prążki mogą wynikać z niepełnej deglikozylacji lub z obecności wielu niezidentyfikowanych białek w próbce beta HCG.

Odczynnik emerald green utlenia i barwi wszystkie glikany obecne w cząsteczce białka. W związku z tym intensywność sygnału spada w miarę enzymatycznej deglikozylacji beta-HCG. Sygnał szczątkowy w ścieżce trzeciej i czwartej wskazuje na obecność motywów glikanowych, które są odporne na zastosowane enzymy.

Dodatkowy glikosylan zastosowano w czwartej ścieżce. Usunięto kilka dodatkowych reszt cukrowych. Migracja białka pozostaje taka sama, jednak widoczny jest niewielki spadek intensywności barwienia.

Odporne reszty cukrowe nie występowały we wszystkich gatunkach białek. Niektóre prążki nie zostały wykryte przez emerald Green, co wskazuje na to, że zostały one w znacznym stopniu deglikozylowane. Dodatkowe dane potwierdzają wniosek, że HCG beta jest heterogennie glikozylowane. Dolny prążek w ścieżce drugiej jest słabo widoczny na obrazie emerald green.

Podczas gdy górny prążek w ścieżce drugiej jest jasny, co wskazuje na obecność wielu grup GLYCAN, dane te potwierdzają wniosek, że rekombinowany HCG beta ekspresowany w komórkach mysich zawiera wiele glikoform ze względu na naturalną heterogenność glikozylacji. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak spektrometria mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. jaki jest stopień zajętości? Jaki jest zakres glikozylacji lub jaka jest struktura szczegółowa glikanów?

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać glycosylate do enzymatycznej deglikozylacji oraz analizy glikanów typu N-linked w glikoproteinach. Wybór metody detekcji może być trudny, ponieważ barwienie białek jest przydatne tylko wtedy, gdy deglikozylacja powoduje znaczną zmianę masy cząsteczkowej w przypadku innych białek.

Zaobserwowaliśmy nieprawidłowe migracje po deglikozylacji i stwierdziliśmy, że każda zmiana w migracji jest dowodem na to, że białko zostało deglikozylowane.