Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualna inspekcja i charakterystyka migracji komórek nowotworowych przez kompartymentacyjne urządzenie mikroprzepływowe. Zostaje to osiągnięte najpierw poprzez dysocjację istniejących neurosfer macierzystych komórek guza mózgu hodowanych w medium bezeżyserkowym. Drugim krokiem jest wykonanie dwuwarstwowej formy z SU-8 i użycie litografii miękkiej do stworzenia stempla z PDMS o konstrukcji kompartymentacyjnej.

W następnym kroku należy zmontować urządzenie mikroprzepływowe i wprowadzić do niego macierzyste komórki nowotworu mózgu. Następnie, przy użyciu zintegrowanego systemu mikroskopowego, wykonuje się długoterminowe obrazowanie poklatkowe migracji macierzystych komórek nowotworu mózgu. Ostatecznie wyniki pokazują, że macierzyste komórki nowotworu mózgu wykazują cykliczną sekwencję etapów morfologicznych podczas migracji przez ultra-ograniczoną przestrzeń.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi rozwiązaniami, takimi jak komory Boydena Transwell, jest fakt, że urządzenia mikroprzepływowe umożliwiają wizualną inspekcję procesu migracji, kontrolowane rozmieszczenie komórek oraz precyzyjne dostarczanie czynników. W związku z tym technologia mikroprzepływowa charakteryzuje się niezawodnym, wydajnym i kosztowo efektywnym sposobem selekcji i nawigacji pojedynczych komórek. Zastosowania tej techniki obejmują terapię przerzutów i nawrotów nowotworowych, ponieważ analiza pojedynczych komórek o wysokiej zdolności migracyjnej może pozwolić na zidentyfikowanie potencjalnych przyszłych celów chemioterapeutycznych.

Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w mechanizmy migracji w układach nowotworowych, może być ona również zastosowana w innych układach, takich jak rozwój embrionalny, odpowiedzi odpornościowe, gojenie ran oraz regeneracja narządów. Rozpocznij od zawiesiny komórek neurosfer pochodzących z BTSC. Przenieś komórki do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwiruj je przy 900 RPM przez pięć minut, nie przekraczając tej prędkości.

Odssać supernatant. Następnie pozwolić na rozluźnienie neurosfer poprzez inkubację w 0,5 ml podgrzanego Accutane przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji rozbić komórki mechanicznie, wykonując 10 do 20 delikatnych pociągnięć pipetą P 100.

Następnie dodaj 1,5 ml pożywki do komórek macierzystych, aby zneutralizować Accutane, odwiruj zawiesinę komórkową z prędkością 1300 RPM przez pięć minut i resuspenderuj komórki w 1 ml pożywki do komórek macierzystych. Sprawdź gęstość komórek za pomocą komory hemodynamicznej i dostosuj gęstość do poziomu 20 000 komórek na µl. Aby rozpocząć wytwarzanie matrycy SU8, przygotuj dwie fotomaski, korzystając z programu Adobe Illustrator oraz folii do druku laserowego Image Setter.

Pierwsza warstwa maski światłoczułej składa się z dwóch markerów referencyjnych oraz macierzy mikrokanałów, natomiast druga warstwa maski zawiera komory osadzające i odbiorcze. Oczyść obie warstwy maski izopropanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie nałóż metodą spin-coatingu na wafer nośny warstwę fotorezystu SU-8 o grubości trzech mikronów, a następnie przeprowadź wstępne wygrzewanie (soft baking).

Następnie, przy ścisłym kontakcie z maską fotolitograficzną pierwszej warstwy, naświetlć fotorezyst i pozwolić mu utrwalić. Następnie przeprowadzić wygrzewanie wtórne (post-bake) i wywołać utrwalony wafle. Obszary markerów referencyjnych na waflu nośnym zakleić taśmą klejącą.

Następnie nanieś na wafer fotorezyst o grubości 250 mikronów metodą spin coatingu. Po tym odklej taśmę, aby odsłonić znaczniki służące do pozycjonowania. Nanieś drugą warstwę fotorezystu i wyrównaj znaczniki referencyjne.

Następnie poddano drugą warstwę fotomaski naświetlaniu promieniowaniem UV i utwardzeniu, po czym wykonano wygrzewanie końcowe (post-baking) oraz wywoływanie. Następnie matrycę z SU-8 poddano procesowi izacji poprzez osadzanie z fazy gazowej, aby zmniejszyć lepkość powierzchni. Wafla umieszczono w eksykatorze z kilkoma kroplami roztworu trichloroetylenu w próżni na co najmniej jedną godzinę.

Matryca będzie następnie gotowa do formowania PDMS. Należy rozpocząć od dokładnego zmieszania bazy prepolimeru z utwardzaczem w stosunku 10:1. Następnie mieszaninę należy umieścić w deskrypatorze w celu odgazowania próżniowego, aż do momentu całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza.

Wlej mieszaninę na maskę i ponownie odgazuj. Jeśli pojawią się nowe pęcherzyki powietrza, utwardz formę na wypoziomowanej płycie grzejnej przez dwie godziny w temperaturze 90 °C. Po ostygnięciu do temperatury pokojowej ostrożnie oddziel stempel PDMS.

W ten sposób kanały hodowlane zostają wytrawione w PDMS i są gotowe do montażu urządzenia mikrofluidycznego. Matryca może być wielokrotnie wykorzystywana do odlewania, dopóki nie pęknie lub nie ulegnie zużyciu. Gdy matryca stanie się lepka, można ponownie nałożyć powłokę antyprzylepną.

Zacznij od wykonania wlotów i wylotów w urządzeniu mikroprzepływowym za pomocą stempla z PDMS. Używając narzędzia do biopsji, oczyść stempel z PDMS, mocząc go w 70% etanolu przez 30 minut, a następnie płucząc wodą dejonizowaną przez 10 minut. Sterylizuj i dopełnij reakcje sieciowania stempla z PDMS poprzez autoklawowanie.

Następnie należy położyć stempel z PDMS na szklanym szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną. Urządzenie jest następnie pokrywane lamininą poprzez wypełnienie komór roztworem lamininy przez wloty zbiorników, a następnie inkubowane przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia należy odessać lamininę z urządzenia.

Następnie przemyj urządzenie, dwukrotnie przepłukując je pożywką do hodowli komórek macierzystych. Teraz wprowadź 11 µL zdysocjowanych komórek do jednego z zbiorników do wysiewania. W razie potrzeby zastosuj aspirację próżniową, aby wprowadzić komórki do komory. Następnie wprowadź dodatkowe 7 µL komórek do sąsiedniego zbiornika do wysiewania.

Po pięciu minutach zbiorniki osadzające i odbiorcze zostaną zalane pożywką. Następnie należy położyć na urządzeniu sterylną arkusz PDMS o grubości od 0,5 do 1 mm. Naturalna adhezja powierzchniowa PDMS do samego siebie uszczelni urządzenie; po uszczelnieniu jest ono gotowe do transportu, inkubacji oraz obrazowania mikroskopowego.

Wstępnie wyrównaj temperaturę biotu, IM, uruchamiając go na 45 minut. Aby ustabilizować temperaturę, wilgotność i dopływ powietrza, umieść w komorze próbkowej kilka naczyń z wodą w celu uzyskania odpowiedniej wilgotności. Umieść przygotowane urządzenie w komorze próbkowej mikroskopu.

Wycentruj urządzenie za pomocą mikropincet. Następnie ustaw punkty ostrzenia oraz punkty czasowe w oprogramowaniu Biot i, jeśli jest to konieczne, rozpocznij rejestrację time-lapse. Po pięciu dniach hodowli wymień pożywkę hodowlaną.

Komórki BTC zasiane w urządzeniu były stale rejestrowane za pomocą obrazowania fazowego. Przez pięć dni w komorze osadczej komórki o wrzecionowatym kształcie pozostawały w stadium przedmigracyjnym. W miarę zbliżania się do wlotu mikrokanału kilka komórek powiększyło się i wytworzyło wypustki adhezyjne.

Tylko jedna komórka była w stanie zająć wejście i zbadać kierunek migracji. Po ustaleniu kierunku migracji komórka zaczęła przemieszczać się przez cały mikrokanał ze stałą, wysoką prędkością. Na końcu mikrokanału komórka zbadała otwartą przestrzeń komory odbiorczej, zanim ostatecznie do niej wniknęła.

Obserwacja komórek w dwóch odstępach czasu między obrazowaniem wykazała, że siła migracji wydawała się wynikać głównie z aktywności bąblowania, podobnej do tej obserwowanej w komórkach OID. Podczas wykonywania procedury należy pamiętać, że konstrukcja urządzenia jest na tyle elastyczna, że wymiary mikrokanałów można modyfikować w celu uzyskania pożądanego stopnia migracji komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak stworzyć unikalne kompartymentujące urządzenie mikrofluidyczne odpowiednie do hodowli wybranych komórek, a następnie przeprowadzić długoterminowe obrazowanie time-lapse, aby jakościowo i ilościowo określić charakterystykę migracyjną tych komórek zgodnie z opisaną procedurą.

W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak stopień zróżnicowania genetycznego wysoce migrujących komórek nowotworowych, można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji lub mikromacierze DNA.