Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest nadanie bakteriom właściwości adhezyjnych w celu ułatwienia ich oddzielenia od mediów ciekłych. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie syntetycznego curli, aby ominąć złożoną regulację genetyczną i umożliwić łatwą oraz masową produkcję lepkich polimerów. W drugim kroku bakterie adhezyjne są wizualizowane i ilościowo oznaczane na polistyrenie, co pozwala na szybką ocenę wydajności urządzenia syntetycznego.

Następnie bakterie przylegające do szkła są wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. W celu bezpośredniej obserwacji biofilmu i uzyskania informacji o jego strukturze, uzyskano wyniki wykazujące znaczący wzrost adhezji u szczepu zawierającego urządzenie syntetyczne, co potwierdzono zarówno za pomocą pomiaru procentowego adhezji, jak i obserwacji mikroskopowych. Główną zaletą podejścia biologii syntetycznej w stosunku do istniejących metod, takich jak konwencjonalne klonowanie, jest możliwość bardzo szybkiego uzyskania konstruktu zawierającego wyłącznie absolutnie niezbędne geny z odpowiednimi sygnałami.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie bioremediacji, takie jak rozwiązanie problemu usuwania bakterii obciążonych metalami z odpadów radioaktywnych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wymagana jest podstawowa wiedza na temat genetycznych sygnałów regulacyjnych oraz obsługi baz danych. Demonstracja wizualna skupi się na kwantyfikacji i wizualizacji biofilmu, ponieważ oba te etapy są bardzo trudne do opanowania ze względu na kruchość struktur biofilmu.

Pierwszym krokiem w projektowaniu syntetycznego carronu jest określenie organizacji genetycznej genów curly oraz lokalizacja ich endogennych sygnałów transkrypcyjnych i translacyjnych. Jest to realizowane przy użyciu wyspecjalizowanych baz danych, takich jak REON DB lub eco gene. Kolejnym krokiem jest wybór pięciu genów absolutnie niezbędnych do syntezy curly: CSGB i CSGA kodują monomery włókien, natomiast C-S-G-E-C-S-G-F i CSGG kodują kompleks sekrecji curly. Wybrane sekwencje należy wyeksportować z bazy danych w formacie FASTA; zarządzanie danymi oraz wstępna analiza in silico zostaną przeprowadzone za pomocą oprogramowania Clone Manager, ponieważ klaster C-S-G-G-F-E w genomie e coli jest w orientacji antysensownej.

Sekwencję tę należy przekształcić w jej odwrotny komplement. Korzystając z narzędzi menedżera klonów, wykonaj operację procesu cząsteczki: odwróć cząsteczkę, a następnie wklej sekwencję C-S-G-E-F-G za C-S-G-B-A, używając funkcji ligacji. Następnie dodaj odpowiedni promotor PRCN przed sekwencją iCal C-S-G-B-A-E-F-G.

Lokus RCN koduje pompę FLX RCNA, odpowiedzialną za detoksykację niklu i kobaltu, oraz powiązany z nią regulator metaliczny RCNR. W przypadku braku kobaltu lub niklu, represor RCNR wiąże się z sekwencją RCNR box w DNA i zapobiega pełnej aktywacji transkrypcji genów znajdujących się w dół strumienia. Jeśli wewnątrzkomórkowe stężenie kobaltu lub niklu wzrośnie, wiązanie kobaltu lub niklu z białkiem RCNR uniemożliwia przytwierdzenie represora do promotora, a aktywność transkrypcyjna P-R-C-N-A wzrasta, stawiając pięć wybranych genów curly pod kontrolą promotora.

Przewiduje się, że PRCN curly będą nadprodukowane w obecności kobaltu i niklu. Następnie należy zoptymalizować sygnały transkrypcyjne poprzez dodanie idealnej sekwencji wiążącej rybosom (RBS) przed pierwszym kodonem ATG w sekwencji DNA CS gba oraz drugiego idealnego RBS przed sekwencją C-S-G-E-F-G. Aby spełnić standardy iGM, urządzenie musi być flankowane przez standardowy prefiks BioBrick zawierający miejsca restrykcyjne dla EcoRI i XbaI oraz sufiks zawierający miejsca restrykcyjne dla SpeI i PstI w celu ułatwienia dalszego montażu.

Sama część bio-brick nie może zawierać żadnych miejsc rozpoznawania przez EcoRI, PstI, SpeI oraz XbaI. W związku z tym miejsca te zostały usunięte poprzez ciche mutacje. Analiza restrykcyjna in silico urządzenia wykazała obecność jednego miejsca PstI w sekwencji CSGA, jednego miejsca PstI w sekwencji RCNR oraz jednego miejsca EcoRI w genie CSGE. Miejsca te zostały zmodyfikowane za pomocą cichych mutacji.

Po zakończeniu projektowania syntetycznego operonu, przeprowadź symulację translacji przy użyciu oprogramowania do zarządzania klonami (clone manager). Użyj programu do dopasowania sekwencji blast, aby zweryfikować pełną homologię między białkami curly typu dzikiego a białkami kodowanymi przez syntetyczny operon. Aby rozpocząć tę procedurę, w każdej studience 24-studzienkowej płytki polistyrenowej umieść 2 mL minimalnego medium M 63 z 0,2% glukozy, a następnie zaszczep każdą studzienkę 10⁶ komórek nocnej hodowli bakteryjnej. Hoduj bakterie w temperaturze 30 °C przez 18 do 48 godzin bez wytrząsania. Każda kolumna płytki 24-studzienkowej reprezentuje jedną modalność.

W razie potrzeby dodaje się odpowiednią ilość kobaltu i antybiotyku. Trzy pierwsze rzędy służą do ilościowego oznaczenia bakterii przylegających A poprzez wyciągnięcie średniej z trzech powtórzeń. Ostatni rząd po lewej służy do wizualizacji biofilmu za pomocą barwienia fioletem krystalicznym po 18 do 48 godzinach; następnie odzyskuje się nadsącz zawierający komórki planktoniczne z każdej studni z trzech pierwszych rzędów płytki 24-dołkowej i przenosi nadsącz do probówki do hemolizy.

Każdą studienkę należy ostrożnie wypłukać za pomocą 1 mL pożywki M 63, a następnie przenieść płuczuk do probówki do hemolizy wraz z początkowym nadsączem. Tę pulę określa się mianem komórek pływających (S). Dno studienek w mikropłytce jest pokryte komórkami przylegającymi. Aby odzyskać biofilm, należy dodać do każdej z nich 1 mL pożywki M 63.

Następnie należy zeskrobać materiał końcówką pipety, wykonać kilka razy pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść frakcję biofilmu do nowej probówki do hemolizy. Probówkę należy mieszać na wortexie przez 15 sekund. Frakcję biofilmu należy gromadzić w probówkach do hemolizy.

Ta pula reprezentuje komórki przylegające do powierzchni nazwane B; przenieś 200 µL nadsączu i frakcji biofilmu z probówek do płytki 96-dołkowej. Oszacuj liczbę bakterii przylegających do powierzchni oraz bakterii pływających na podstawie gęstości optycznej przy 600 nm. Procent przylegania dla każdego wariantu oblicza się według wzoru B razy 100 podzielone przez 3 razy S plus B. Aby zwizualizować biofilm, w przypadku tylko ostatniego rzędu płytki 24-dołkowej, usuń komórki planktoniczne z tych dołków.

Do każdego dołka dodaj 1 ml pożywki M 63, aby wypłukać biofilm, który rozwinął się na dnie płytki. Pozostaw odsłoniętą płytkę do wyschnięcia na jedną godzinę w temperaturze 80 °C; po tym czasie dodaj do każdego dołka 100 µL 20% fioletu krystalicznego, a następnie przeprowadź dokładne przemycia wodą. Do wykonania tego protokołu wymagane jest chassis fluorescencyjne.

Odpowiednim gospodarzem dla plazmidu niosącego syntetyczne curli jest szczep e coli SCC one, który konstytutywnie ekspresuje zielone białko fluorescencyjne i nie wykazuje widocznych różnic w stosunku do szczepu rodzicielskiego MG 1 16 55. Przekształć szczep gospodarza za pomocą plazmidu puck 57 niosącego syntetyczne curli, aby uzyskać szczep S 23. Przekształć szczep gospodarza za pomocą plazmidu kontrolnego puck 18, aby uzyskać szczep kontrolny.

Przez noc hoduj prekultury szczepów S 23 i S 24 w temperaturze 30 °C w pożywce M 63 uzupełnionej o glukozę i ampicylinę. Następnego dnia wlej 20 ml pożywki M 63 do szalki Petriego, a następnie zaszczep 15 ml pożywki M 63 w szalkach Petriego, dodając 100 µl prekultur. Dodaj odpowiednie stężenie kobaltu i pamiętaj o przygotowaniu kontroli negatywnej bez kobaltu.

Do każdej szalki Petriego włóż trzy prostokątne szkiełka nakrywkowe. Inkubuj szalki przez noc w temperaturze 30 °C bez wytrząsania. Bakterie można wizualizować bezpośrednio pod mikroskopem fluorescencyjnym w kolejnych dniach.

Należy unikać wysychania próbki, dlatego kolejne kroki muszą zostać wykonane starannie, lecz szybko. Należy zdjąć każde szkiełko nakrywkowe z szalek Petriego i ostrożnie je odlać. Dolną powierzchnię należy starannie oczyścić małym patyczkiem bawełnianym nasączonym 70% etanolem, aby usunąć wszystkie pozostałości bakterii przed obserwacją konfokalną.

Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym stroną z biofilmem skierowaną do góry. Biofilm należy następnie przykryć większym szkiełkiem nakrywkowym, które następnie przytwierdza się do szkiełka przedmiotowego za pomocą lakieru.

Odwróć układ tak, aby biofilm znalazł się na dolnej powierzchni. W tym doświadczeniu umieść układ pod konfokalnym mikroskopem laserowym. W ramach platformy CT micro wykorzystano konfokalny mikroskop laserowy Zeiss LSM 510 Meta.

Wybierz obiektyw imersyjny 40×. Zastosuj następujące ustawienia: wzbudź GFP przy 488 nanometrach i zbierz fluorescencję bakteryjną w zakresie od 500 do 600 nanometrów. Do pozyskiwania obrazów użyj obiektywu imersyjnego 40×.

W trybie konfokalnej mikroskopii skaningowej. Skanowanie ogólnych struktur trójwymiarowych biofilmów od powierzchni stałej do interfejsu z pożywką wzrostową. Należy zastosować krok wynoszący 1 µm.

Należy wykonać projekcje trójwymiarowe przy użyciu oprogramowania maus, a następnie określić grubość biofilmu poprzez analizę średniej wartości C wzdłuż statystycznych przekrojów podłużnych. Ilościowe oznaczenie biofilmu oraz objętości biologiczne mogą zostać wyodrębnione ze stosów Z z mikroskopii konfokalnej. Zdolności adhezyjne szczepów e coli zmodyfikowanych genetycznie w celu nadprodukcji curly w odpowiedzi na obecność metalu można ocenić za pomocą prostych metod.

Na przykład barwienie fioletem krystalicznym na polerowanych płytkach 24-dołkowych Irene umożliwia szybką wizualizację tworzenia się biofilmu na dnie każdego dołka, co obrazuje różnica w intensywności fioletowego koloru. Wydaje się, że szczep typu dzikiego wykazuje mniejszą adhezję niż szczep zmodyfikowany. Metodą ilościową jest pomiar procentowego stopnia adhezji do polistyrenu szczepów typu dzikiego i zmodyfikowanych przy różnych stężeniach kobaltu.

Wyniki przedstawione na tym wykresie wykazują, że procentowa adhezja szczepu zmodyfikowanego jest 1,5 raza wyższa niż w przypadku szczepu typu dzikiego w warunkach braku kobaltu. Ponadto zaobserwowano znaczące wzmocnienie adhezji wraz ze wzrostem stężeń kobaltu; w pożywkach o stężeniu kobaltu 25 µM lub 50 µM procentowa adhezja komórek zmodyfikowanych osiąga odpowiednio 30% i 40%. Zdolności adhezyjne można porównać również za pomocą mikroskopii z wykorzystaniem bakterii znakowanych GFP hodowanych na szkiełkach przedmiotowych; obserwacje w mikroskopie epifluorescencyjnym wykazują zielone bakterie na czarnym tle, gdzie szczep zmodyfikowany tworzy biofilm, podczas gdy szczep typu dzikiego tworzy jedynie mikrokolonie wskazane strzałkami.

Analiza za pomocą mikroskopii konfokalnej zapewnia ogólny wgląd w trójwymiarową strukturę biofilmu. Rekonstrukcje widoku z góry przedstawiono w panelach A, a rekonstrukcje widoku z boku w panelach B. Wyniki potwierdzają, że szczep zmodyfikowany wykazuje większą adhezję oraz tworzy gęstszy i grubszy biofilm niż typ dziki. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest ponowne sprawdzenie projektu badania, na przykład w celu zbadania potencjału bioremediacyjnego zmodyfikowanych e coli lub occus ants w kontekście radioaktywnych ścieków.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat projektowania syntetycznego otworu przy użyciu oprogramowania do zarządzania klonami oraz sposobu szybkiej kwantyfikacji ekspresji szczepów bakteryjnych. Proszę pamiętać, że praca z genami syntetycznymi i organizmami modyfikowanymi genetycznie może być niezwykle niebezpieczna. Muszą one być obsługiwane zgodnie z obowiązującymi przepisami, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak autoklawowanie bakterii transformowanych.