Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest integracja pożądanej konstrukcji DNA z chromosomem bakteryjnym w określonym locus. Jest to osiągane za pomocą protokołu kojarzenia z wykorzystaniem czterech zmodyfikowanych szczepów bakteryjnych. Szczep biorcy posiada sekwencję platformy lądowiskowej (landing pad), składającą się z genu oporności na specmycynę oraz genu beta-glukuronidazy e coli, flankowanych przez miejsca ATP zintegrowane z jego chromosomem.

Szczep donora P JH one 10 zawiera plazmid posiadający miejsca B flankujące gen wypełniający kodujący czerwone białko fluorescencyjne oraz gen oporności na antybiotyk. Szczep donora PJC two zawiera plazmid posiadający specyficzną dla miejsca integrazę z bakteriofaga C 31 streptomyces pod kontrolą promotora LAC. Czwarty szczep MT 616 dostarcza genów transferu niezbędnych do konjugacji, co umożliwia przenoszenie plazmidów z komórki do komórki i prowadzi do powstania transgenów w szczepach biorcy.

Pozyskanie dwóch plazmidów wymaganych do wymiany kasety pośredniczonej przez integrazę. Wymiana kasety donora z plazmidu PJ H one 10 na markery kasety lądowiska (landing pad) na chromosomie skutkuje utratą markerów lądowiska, SPR i UIDA, oraz zachowaniem kasety donora RFP i GMR w powstałym transmigrancie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak rekombinacja homologiczna, jest prostota i wydajność protokołu.

Jest ona również przenaszalna na szeroki zakres bakterii. Szczep akceptujący użyty w tym filmie to szczep S. milli latte. Na dwa dni przed procedurą kojarzenia w celu stworzenia trans-integronów, zaszczep z pojedynczej kolonii do 5 ml pożywki TY z dodatkiem spectmycyny. Inkubuj szczep S. milli w temperaturze 30 °C przez dwa dni przy ciągłym mieszaniu. W dniu poprzedzającym procedurę kojarzenia, zaszczep każdy z następujących szczepów E. coli do 5 ml płynnej pożywki LB uzupełnionej o odpowiedni antybiotyk: DH5α zawierający plazmid ekspresyjny integrazą do pożywki z tetracykliną, MT616 (mobilizator) do pożywki z chloramfenikolem oraz DH5α zawierający plazmid z kasetą donorową do pożywki z gentamycyną. Inkubuj trzy szczepy E. coli przez noc w temperaturze 37 °C przy stałym mieszaniu. Aby przygotować komórki do procedury kojarzenia, przenieś 1,5 ml każdej z czterech kultur do probówki i wiruj przy 17 000 ×g przez 30 s, aby zebrać osad komórkowy. Odlej pożywkę i resuspenduj każdy osad komórkowy w 1 ml sterylnego 0,85% NaCl. Ponownie wiruj probówki, a po odlaniu supernatantu resuspenduj każdy osad w 100 µL sterylnego 0,85% NaCl. Za pomocą pipety nanieś punktowo 10 µL przemytej kultury każdego szczepu na zwykłą płytkę z agarem TY.

Te plamki są plamkami kontrolnymi. Następnie do sterylnej probówki należy dodać 40 µL każdego szczepu, z wyłączeniem e coli DH5α zawierającego Pjc2, i wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół; na zwykłą płytkę z agarem TY nanosi się 120 µL tej mieszaniny. Plamka ta stanowi negatywną kontrolę bez integrazą.

Na koniec dodaj 40 µL każdego z czterech szczepów do sterylnej probówki, wymieszaj i nanieś 160 µL tej mieszaniny na tę samą płytkę z agarem TDY. Plamka ta stanowi miejsce krzyżowania z wykorzystaniem wymiany kasety pośredniczonej przez integrazę.

Umieść płytkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza i pozostaw plamki do wyschnięcia na około 20 minut. Uszczelnij płytkę i inkubuj w temperaturze 30 °C przez noc, następnego dnia po wykonaniu procedury kreskowania po kojeniu. Przenieś dwie plamki kontrolne oraz plamkę kojenia IMCE na płytki z agarem TY uzupełnionym o streptomycynę i gentamycynę.

Szczep akceptor S milli posiada mutację zapewniającą wysoki poziom oporności na streptomycynę, co umożliwia obliczenie wydajności IMCE. Zawiesić około jednej czwartej plamki kojarzenia IMCE w 500 µl sterylnego 0,85% NaCl. Wykonać dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne do stężenia 10⁻⁷. Rozcieńczenia od 10⁻² do 10⁻⁵ wysiać na płytki z agarem TY uzupełnionym o streptomycynę, gentamycynę i xgl w celu selekcji transmigrantów. Rozcieńczenia od 10⁻³ do 10⁻⁷ wysiać na płytki z agarem TY uzupełnionym o streptomycynę i xgl w celu selekcji zarówno transmigrantów, jak i potencjalnych biorców. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez trzy dni.

Obserwuj RFP trans pod zielonym światłem i przez czerwony filtr; oblicz procent wydajności IMCE jako stosunek CFU imigrantów trans do CFU wszystkich biorców. Około połowa trans przejdzie prawdziwą wymianę, co sprawi, że po trzech dniach inkubacji na podłożu Ty uzupełnionym o streptomycynę i gentamycynę będą one białe i niepodatne na antybiotyki. W następujących szczepach kontrolnych nie powinien wystąpić wzrost: kontrola bez integrazu s milli latte UW 2 27, kontrola e coli MT 616, kontrola e coli DH five alpha zawierająca P JH one 10 oraz kontrola e coli DH five alpha zawierająca PJC two. W przeciwieństwie do nich, posiew IMCE z miejsca kojenia powinien wykazać zlewający się wzrost na pierwszym pasie i liczne kolonie na drugim pasie. Dwa kolejne obrazy przedstawiają resuspensje rozcieńczenia 10⁻² miejsca kojenia na agarze TY streptomycyna xgl oraz na agarze TY streptomycyna gentamycyna xgl.

Niebieskie kolonie to pojedyncze rekombinanty. Podczas gdy kolonie białe są trans-integrinami, które przeszły rzeczywistą wymianę kasety, w obserwacji w zielonym świetle i przez czerwony filtr zawiesina resuspensyjna z plamki kojarzenia w rozcieńczeniu 10⁻² na agarze TY strept cin xgl nie wykazuje fluorescencji. W przeciwieństwie do tego, rozcieńczenie 10⁻² zawiesiny resuspensyjnej z plamki kojarzenia na agarze Ty z streptomycyną, gentamycyną i xgl wykazuje dwa poziomy fluorescencji.

Jaśniejsze kolonie odpowiadają koloniom niebieskim i wykazują wyższą ekspresję RFP, co prawdopodobnie wynika z odczytu przechodzącego (read-through) z promotora LAC w wektorze. Mniej jasne kolonie odpowiadają koloniom białym, w których doszło do właściwej wymiany kasety i które zawierają RFP jedynie z jego bezpośrednim promotorem, bez odczytu przechodzącego z promotora LAC. Kolonie te powinny być również wrażliwe na specycyminę.

Wydajność integracji trans powinna mieścić się w zakresie 0,5%, wyrażona jako procent transmigrantów w stosunku do całkowitej liczby biorców. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób wykorzystania konjugacji bakteryjnej z użyciem naszych zmodyfikowanych szczepów do wstawiania konstruktów DNA do chromosomu bakteryjnego.