Monitorowanie reakcji połowicznych redukcyjnych i utleniających monooksygenazy zależnej od flawiny z wykorzystaniem spektrofotometrii z szybkim mieszaniem (stopped-flow)

Niniejsza procedura wykorzystuje urządzenie do przepływu zatrzymanego (stopped flow) w celu wykrycia różnych form widmowych SID A oraz pomiaru szybkości reakcji. Reakcja katalizowana przez SID A może zostać podzielona na redukcyjną i oksydacyjną półreakcję FAD. Utleniona flawina wiąże N-A-D-P-H i reaguje, tworząc zredukowaną flawinę oraz NADP; dodatkowo reakcja z tlenem cząsteczkowym i wiązanie ornityny prowadzą do powstania C four.

Po hydroksylacji ornityny powstaje hydroksyflawina, która następnie ulega dehydratacji, tworząc utleniony enzym. NADP⁺ pozostaje związany przez cały cykl katalityczny i jest ostatnim uwalnianym substratem. Urządzenie do szybkich przepływów (stopped-flow) umożliwia szybkie mieszanie małych objętości reagentów oraz rejestrację pomiarów.

Zmiany widmowe w czasie mierzone za pomocą spektrofotometru pozwalają na oznaczenie szybkości powstawania produktów i substratów w reakcji katalizowanej enzymatycznie, w szczególności w odniesieniu do przejściowych produktów pośrednich. Dwoje członków mojego laboratorium, Rita Robinson i Enviro Romero, zaprezentuje te eksperymenty, wykorzystując zestaw A z flawinową monooksygenazą jako układ modelowy. Wlej 250 ml buforu fosforanowego potasu o stężeniu 100 mM do kolby Buchnera o pojemności 500 ml zawierającej mieszadło magnetyczne.

Zamknąć kolbę korkiem gumowym, następnie umieścić ją na mieszalce magnetycznej i podłączyć krótkie ramie kolby do linii Schlenka. Odgazować bufor w próżni przez godzinę w temperaturze pokojowej przy jednoczesnym mieszaniu, a następnie przepłukać argonem. Powtórzyć tę procedurę pięć razy.

Na koniec przemyj kolbę argonem przez 10 sekund. Odłącz kolbę od manifoldu próżniowego i umieść ją wewnątrz komory rękawicowej. Kontynuuj energiczne mieszanie przy otwartej kolbie.

Napełnić strzykawki zbiornicze roztworem oksydazy glukozowej o stężeniu 18,13 jednostek na mililitr oraz 100 milimolarnym roztworem glukozy. Następnie ustawić zawory napędowe w pozycji ładowania. Napełnić strzykawki napędowe.

Następnie przekręć zawór F do pozycji napędowej. W oprogramowaniu do sterowania danymi pro kliknij opróżnij strzykawkę stopową, a następnie przesuń bufor ze strzykawki napędowej F przez obwód przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiedni tłok napędowy. Powtórz tę czynność dla pozostałych trzech strzykawek napędowych i pozostaw do równoważenia przez godzinę.

Następnie ponownie napełnij strzykawki zbiornika i powtórz płukanie układu o zatrzymanym przepływie. Aby przygotować bufor nasycony tlenem, przedmuchuj roztwór 100%tlenem przez jedną godzinę przy jednoczesnym mieszaniu.

Następnie wyjmij krótką igłę z fiolki i odczekaj 10 sekund. Następnie wyjmij długą igłę i umieść zamkniętą fiolkę w komorze rękawicowej. W przypadku roztworu N-A-D-P-H.

Umieścić w komorze rękawicowej probówkę typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającą 1 mg NADPH. Rozpuścić w 300 µl anaerobowego buforu fosforanowego potasu o stężeniu 100 mM, pH 7,5.

Odbierz 30 µL w celu oznaczenia stężenia N-A-D-P-H. Aby usunąć tlen z zapasu enzymu, przenieś roztwór do fiolki o pojemności 25 mL wyposażonej w mieszadło magnetyczne, korek z watą i aluminiową plombę. Umieść na lodzie.

Podłącz do linii Schlenka, następnie odgazuj pod próżnią przez 20 minut, a następnie przepłucz argonem. Na koniec przepłucz fiolkę argonem przez 10 sekund i odłącz ją od manifoldu próżniowego. Umieść fiolkę w lodzie wewnątrz rękawicy (glove box).

W oknie panelu sterowania oprogramowania Pro Data Control wybierz opcje: photo diode array, external trigger oraz logarithmic scale. Uruchom również oprogramowanie Pro Data Viewer i określ katalog do przechowywania plików danych.

Następnie zastąp roztwór w strzykawkach zbiorniczych C i F beztlenowym 100 milimolarnym buforem fosforanowym potasu o pH 7,5. Przełącz zawory C i F w pozycję napędową. Kliknij opcję opróżniania strzykawki zatrzymującej w oprogramowaniu sterującym pro data.

Następnie wypchnij bufor z obu strzykawek napędowych przez obwód przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiedni tłok napędowy. Powtórz płukanie za pomocą strzykawek rezerwuarowych C i F jeszcze trzy razy. Aby zapewnić całkowite usunięcie oksydazy glukozowej z obwodu przepływowego, kliknij baseline w oprogramowaniu pro data control.

Zastąp roztwór w strzykawce zbiorniczej F roztworem enzymu. Przekręć zawór F do pozycji napędowej. W oprogramowaniu sterującym pro data kliknij opróżnij strzykawkę stopową.

Wytłocz roztwór enzymu z strzykawki napędowej F przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiadający jej tłok napędowy. Wróć do oprogramowania sterującego danymi pro i ustaw czas akwizycji na 60 sekund. Upewnij się, że obie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiednimi roztworami, a tłoki napędowe stykają się z tłokami strzykawek napędowych.

Przekręć oba zawory do pozycji napędu i kliknij „acquire” w oprogramowaniu pro data control, aby rozpocząć pomiar. Uzyskaj dane widmowe utlenionej formy enzymu w trzech powtórzeniach, wykorzystując wartość A 4 52 nanometer otrzymaną z pomiarów. Wyznacz stężenie enzymu przed zmieszaniem i przygotuj cztery mililitry roztworu N-A-D-P-H.

Napełnij strzykawkę rezerwuarową C roztworem N-A-D-P-H o stężeniu 1,5 raza większym, a następnie opróżnij i napełnij ponownie strzykawkę stopową trzy razy, zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Następnie wykonaj pomiar widm podczas redukcji enzymu, przepłukując zawartość obwodu przepływowego beztlennym buforem fosforanowym z potasu o stężeniu 100 millimolar pH 7,5. Teraz kliknij „baseline” w oprogramowaniu pro data control.

Następnie zmieszaj 200 µL roztworu zapasowego enzymu z 1000 µL beztlenowego buforu fosforanowego potasu o stężeniu 100 mM i pH 7,5. Zastąp roztwór w strzykawce zbiorczej A roztworem enzymu.

Przełącz zawór A w pozycję napędu w oprogramowaniu sterującym pro data. Kliknij przycisk stop syringe empty. Przetłocz roztwór enzymu z tłoka napędowego A przez obwód przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiedni tłok napędu.

Ustaw czas opóźnienia na 0,5 seconds oraz czas akwizycji na 60 seconds. Sprawdź, czy wszystkie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiednimi roztworami, a tłoki napędowe stykają się z tłokami strzykawek napędowych. Następnie przełącz wszystkie zawory napędowe w pozycję napędową i kliknij acquire w oprogramowaniu pro data control.

Należy uzyskać dane widmowe utlenionej formy enzymu w trzech powtórzeniach. Następnie roztwór w strzykawce rezerwuarowej B należy zastąpić roztworem N-A-D-P-H o stężeniu 1,5 raza wyższym niż stężenie enzymu w strzykawce A. Przekręć zawór B do pozycji napędu, a następnie trzy razy opróżnij i napełnij strzykawkę zatrzymującą, zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami w oknie panelu sterowania.

Ustaw czas opóźnienia na 0.5 seconds. W 20 seconds akwizycji wymień roztwór w strzykawce zbiorczej na bufor natleniony. Przełącz zawór C w pozycję napędową.

Przepłucz trzy razy, korzystając z oprogramowania sterującego pro data. Ustaw czas opóźnienia na 15 sekund, a czas akwizycji na 900 sekund. Kontynuuj pozyskiwanie widm podczas reutleniania całkowicie zredukowanego enzymu w urządzeniu do przepływu zatrzymanego (stopped flow).

Anaerobową redukcję SID A za pomocą N-A-D-P-H można monitorować, mierząc zmiany stanu redoks flawiny przy użyciu absorbancji przy 452 nm. Zmiany widmowe są rejestrowane w czasie, od utlenionego SID A do ostatniego widma w pełni zredukowanego SID A. Szybkość tego etapu enzymatycznego można określić, dopasowując dane do odpowiedniego równania. Szybkość utleniania oraz produkty pośrednie reakcji można również wyznaczyć, stosując tryb podwójnego mieszania w urządzeniu stopped flow w tej reakcji dla AF Sid A. Produkt pośredni C four A Hydroxi flavin jest wyraźnie wykrywalny z λmax wynoszącym 380 nm, natomiast utleniony enzym ma λmax wynoszący 450 nm.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu od czterech do sześciu godzin. Pamiętaj, aby zapewnić beztlenowość roztworom. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak badać zarówno względną, jak i owrzodzeniową jonizację FLA w ramach niezależnych eksperymentów mono w dalszych etapach, takich jak szybka analiza chemiczna.

Metoda Quentin może pomóc w wyjaśnieniu charakteru produktów pośrednich.