Analiza lotnych związków owoców z wykorzystaniem elektronicznego nosa

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie szybkiej analizy związków lotnych w owocach. Osiąga się to najpierw poprzez pocięcie i homogenizację tkanki owocu. Następnie faza par nad próbką ciekłą jest analizowana za pomocą elektronicznego nosa.

Po analizie za pomocą elektronicznego nosa dane są eksportowane i przekształcane. Ostatnim krokiem procedury jest zidentyfikowanie okien indeksu covas i skonsolidowanie pików pod jedną etykietą indeksu covas przy użyciu interfejsu graficznego. Ostatecznie wyniki wykazują, że różnice w obfitości folikuli owoców mierzone elektronicznym nosem mogą być powiązane z zabiegami eksperymentalnymi, takimi jak odmiana owoców, stopień dojrzałości i warunki przechowywania.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjna chromatografia gazowa, jest możliwość szybszej analizy związków lotnych w owocach. Podczas przeprowadzania tej analizy mogą wystąpić niewielkie zmiany w czasach retencji analitów. Mogłoby to prowadzić do błędnej interpretacji danych bez dokładnego uwzględnienia procesu wyrównywania piku.

Po zbiorze owoców na odpowiednim etapie dojrzałości, należy je opłukać wodą z kranu. Następnie należy wybrać owoce do analizy, usuwając te zanieczyszczone brudem i kurzem. W oparciu o brak zewnętrznych i wewnętrznych defektów oraz wielkość i jednorodność, owoce należy przekroić wzdłuż na cząstki w celu pobrania próbek substancji lotnych.

Jeśli dotyczy, usuń nasiona ze skóry, tkankę z jam nasion lub pestki z owoców. Dobór tkanek musi być spójny w całym eksperymencie, a zmienność w obrębie jednego owocu powinna zostać uwzględniona. Na przykład próbki należy pobierać w równym stopniu z części równikowej, od strony kwiatu oraz od strony szypułki.

Połączyć wybrane tkanki owoców, wymieszać je w celu randomizacji, a następnie odważyć 200 g i przełożyć do komercyjnego blendera. Dodać 200 ml nasyconego roztworu chlorku wapnia. Chlorek wapnia ma za zadanie działać jako inhibitor aktywności enzymatycznej, która może wystąpić po krojeniu i homogenizacji miąższu owoców.

Następnie dodaj 50 µL 100 mM roztworu izomaślanu 2-metylobutylu w metanolu. Roztwór ten jest dodawany jako standard wewnętrzny w celu monitorowania ewentualnych strat związków lotnych podczas procesu homogenizacji. Następnie homogenizuj mieszaninę w blenderze laboratoryjnym przez 30 sekund przy 18 000 RPM.

Następnie niezwłocznie przelej zawartość do szklanej butelki i szczelnie zamknij pokrywką teflonową. Przechowuj homogenizat w butelce aż do momentu przygotowania wszystkich próbek. Pipetą pobierz pięciomililitrowe aliquoty soku bez piany do 20-mililitrowych szklanych fiolek bursztynowych, przygotowując co najmniej trzy fiolki na każdą próbkę.

Aby służyły jako powtórzenia techniczne. Zamknąć fiolki stalowymi zakrętkami z septami z teflonu i silikonu. Na tym etapie próbki można analizować niezwłocznie lub zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze ultraniskiej do późniejszej analizy.

Załaduj odpowiednią metodę analizy do urządzenia Xenos. Wprowadź parametry zgodnie z protokołem pisemnym. Podłącz do wlotu Xenos igłę ze stali nierdzewnej z końcówką nieusuwającą rdzenia.

Przepłucz system kilkakrotnie powietrzem otoczenia, aż linia bazowa stanie się stabilna i nie będą wykrywane żadne piki przekraczające 200 zliczeń. W celu przygotowania instrumentu do strojenia wprowadź igłę do septa fiolki zawierającej roztwór acas o łańcuchu prostym, aby wyrównać ciśnienie. Następnie wprowadź igłę połączoną z wlotem instrumentu do septa.

Przeprowadź strojenie, inicjując próbkowanie przestrzeni nad cieczą. Wynik strojenia jest wykorzystywany przez oprogramowanie instrumentu do konwersji czasu retencji wspomnianych pików z jednostek czasu na indeksy covas lub jednostki KI. W konsekwencji, po zestrojeniu systemu, czasy retencji są raportowane w jednostkach KI.

Rozpocznij analizę próbki po 30-minutowym wyrównaniu stanu próbki, wprowadzając igły do septa fiolki z próbką. Postępuj analogicznie jak w przypadku roztworu prostych łańcuchów acas. Uruchom pobieranie próbki z przestrzeni nad próbką (headspace) ręcznie, klikając przycisk odtwarzania, co aktywuje pompę i spowoduje odessać pary znajdujące się nad próbką.

Po zakończeniu analizy na ekranie wyświetla się chromatogram, a czujnik jest automatycznie podgrzewany do 150 °C przez 10 sekund w celu jego oczyszczenia. Gdy pole stanu systemu ponownie zmieni kolor na zielony, urządzenie jest gotowe do analizy kolejnej próbki. Aby zapewnić stabilną linię bazową i właściwe oczyszczenie systemu, należy przeprowadzić co najmniej jeden pomiar ślepy z powietrzem pomiędzy każdą próbką.

Przeanalizuj co najmniej trzy powtórzenia techniczne dla każdej próbki, a także próbki ślepe z fiolki. Po akwizycji wyeksportuj dane do pliku Microsoft Excel, korzystając z funkcji zapisu danych dziennika (log stored data) w oprogramowaniu Mense. Po wyeksportowaniu danych dodaj kolumny zawierające etykiety dla zmiennych i powtórzeń.

Format danych eksportowanych z oprogramowania urządzenia może zostać przekształcony w celu łatwiejszej manipulacji za pomocą skryptu Python 0.6 opracowanego w tym laboratorium. Nazwa pliku źródłowego i nazwa arkusza dla danych wejściowych, a także pożądana nazwa pliku wyjściowego są edytowane bezpośrednio w skrypcie. Skrypt ten ułatwia manipulację danymi i ich analizę poprzez identyfikację unikalnych kis we wszystkich próbkach.

Dane zostają przeorganizowane tak, aby informacje o próbkach znajdowały się w wierszach, a unikalne wartości KIS w kolumnach, przy czym każda komórka reprezentuje odpowiadającą jej powierzchnię piku. Jeśli dla danej wartości KI w próbce nie wykryto piku, odpowiednia komórka pozostaje pusta. Następnie, przy użyciu drugiego skryptu wygenerowanego przez ten import laboratorium, przetwarzane są dane z pliku edytowanego w poprzednim kroku.

Analiza opiera się na obserwacji i ocenie liczby wystąpień każdej wartości KI. W związku z tym program wyświetla wykres słupkowy trafień KI. Dla każdej wartości KI należy ocenić liczbę trafień K w określonych podzbiorach próbek, analizując każdą grupę powtórzeń technicznych łącznie.

Aby to zrobić, należy analizować każdą próbę lub zmienną osobno, zaznaczając lub odznaczając odpowiednie pola. Po określeniu szerokości każdego okna KI za pomocą interfejsu graficznego, należy losowo wybrać kilka odpowiadających im chromatogramów. W oprogramowaniu mense należy ocenić nakładanie się pików pomiędzy powtórzeniami technicznymi.

Po wyodrębnieniu okna KI, w interfejsie graficznym wykorzystuje się funkcję łączenia (merge), aby połączyć KIS znajdujące się w oknie z najbardziej licznie obsadzonym ki. Kliknij przycisk merge, aby aktywować tę funkcję, a następnie wybierz najbardziej licznie obsadzone ki w centrum okna, klikając lewym przyciskiem myszy odpowiedni słupek. Po wybraniu słupka zmienia on kolor na zielony; aby połączyć KIS znajdujące się w oknie z wybranym ki, kliknij prawym przyciskiem myszy na odpowiednie słupki.

Powoduje to zmianę koloru słupków na czerwony, podczas gdy nad centralnym ki dodawany jest niebieski słupek o odpowiadającej mu długości. Gdy wszystkie wybrane kis zostaną scalone z odpowiednim centralnym ki, ponownie kliknij przycisk scalania, aby zaakceptować zmiany. Sprawia to, że przycisk scalania zmienia kolor na żółty w przypadku wystąpienia błędów.

Przycisk „unmerge” służy również do rozdzielania. Kliknij przycisk „unmerge” w interfejsie graficznym, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy czerwony pasek, który ma zostać rozdzielony.

Słupek zmienia kolor z czerwonego na niebieski. Ponownie kliknij przycisk odłączania (un merge), aby zatwierdzić zmiany. W przypadku próby nieprawidłowego połączenia dwóch piku w jednej próbce w jedną wartość KI, wyświetli się komunikat o błędzie.

Po zapisaniu pliku po wszystkich operacjach łączenia i przed przystąpieniem do analizy statystycznej, analizuje się chromatogramy próbek ślepych powietrza i fiolek w celu monitorowania ewentualnych zanieczyszczeń. Po zidentyfikowaniu ki pików oraz próbek ślepych, należy odjąć powierzchnię piku wykrytego w próbce ślepej powietrza i/lub fiolki od powierzchni piku obecnego w próbce. Elektronowy nos był w stanie wykryć różnice w profilach lotnych substancji w owocach melona zbieranych na różnych etapach dojrzałości.

Przedstawiono tutaj przykłady chromatogramów z owoców w stadium wczesnej dojrzałości oraz owoców w pełni dojrzałych, ukazujące różnice w powierzchniach pików. Dla wielu pików zidentyfikowano okna 20 K we wszystkich próbkach. Analiza wariancji wykazała, że spośród tych różnych kis, obfitość 14 pików wykrytych przez elektroniczny nos różniła się znacząco pomiędzy dwoma stadiami dojrzałości. Tutaj obfitość pików owoców w stadium wczesnej dojrzałości dla każdego z tych kis przedstawiono kolorem zielonym, a obfitość pików owoców w pełni dojrzałych kolorem pomarańczowym.

Po zakończeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas, w celu zidentyfikowania składników odpowiadających poszczególnym pikom uzyskanym za pomocą nosa elektronicznego po jego opracowaniu. Technika ta dostarczy szybkiego narzędzia analitycznego i pozwoli badaczom z zakresu patologii roślin, fizjologii roślin, biologii pozbiórkowej oraz nauki o żywności badać zmiany w składzie związków lotnych w owocach w zależności od stopnia dojrzałości, odmiany lub warunków przechowywania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak szybko analizować związki lotne za pomocą nosa elektronicznego oraz jak przeprowadzać wyrównanie pików przy użyciu naszego interfejsu graficznego.