Immunohistochemia: skrawki w parafiniie z użyciem zestawu Vectastain ABC firmy Vector Labs

Witajcie, nazywam się Victor Chi i jestem studentem studiów magisterskich w laboratorium Chandy w Katedrze Fizjologii i Biofizyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Dzisiaj zaprezentuję sposób barwienia przekrojów zatopionych w parafinie przy użyciu zestawu VECTStain ABC z Vector Laboratories. Procedura ta obejmuje odparafinowanie i nawilżanie przekrojów zatopionych w parafinie, przeprowadzenie odmaskowywania antygenów metodą HIER, blokowanie peroksydazy oraz niespecyficznego wiązania białek, inkubację z przeciwciałami przeciwko CD4 i tyrozynowej hydroksylazie oraz przeciwciałami wtórnymi, a na koniec wywołanie i montowanie preparatu.

Zacznijmy zatem. Ponieważ preparaty są zatopione w parafinie, pierwszym krokiem jest ich odparafinowanie. Jest to zazwyczaj wykonywane w dygestorium przy użyciu trzech słoików z ksylenem, z trzema etapami płukania, z których każdy trwa pięć minut.

Następnie preparaty przenosi się do stuprocentowego etanolu. Zauważą Państwo, że wosk z preparatów zniknął, jednak należy uważać, aby nie dotykać ich w rękawiczkach, ponieważ ksylen rozpuści gumę, z której są wykonane. Następnie preparaty w stuprocentowym etanolu przenosi się z powrotem do laboratorium, gdzie zostaną poddane gradientowi nawadniania.

W tej części omówię gradient nawadniania, przez który będziemy przeprowadzać nasze preparaty. Proces rozpoczyna się od dwóch kąpieli w 100% etanolu. Następnie przenosimy preparaty do dwóch kąpieli zawierających 95% etanolu.

Następnie przenosimy preparaty do kąpieli w 70% etanolu, a stamtąd do kąpieli w 50% etanolu. Po tym etapie przenosimy preparaty do 30% etanolu, a po dwóch minutach do wody dwukrotnie destylowanej. Po potraktowaniu wodą dwukrotnie destylowaną pozostawiamy preparaty w roztworze PBS.

W tej części pokażę, jak przenosić preparaty między kolejnymi kąpielami przy użyciu kaset. W pierwszym kroku, korzystając z uchwytu kasety, należy wyjąć preparaty i delikatnie je otrzepać, aby usunąć nadmiar cieczy i zapobiec przeniesieniu zbyt dużej jej ilości do następnej kąpieli. Następnie należy zanurzyć preparaty i odczekać dwie minuty do kolejnej zmiany gradientu.

W wielu przypadkach po utrwaleniu tkanek antygen zostaje zamaskowany, co uniemożliwia związanie się z nim przeciwciała. Przedstawię zatem metodę termicznej odmaskowania antygenów z wykorzystaniem cytrynianu sodu. Znajdujemy się teraz przy kuchence mikrofalowej, gdzie przeprowadzę odmaskowanie antygenu CD8, który będę próbował wykryć za pomocą immunohistochemii.

Teraz włożę roztwór do mikrofalówki i będę go podgrzewać przez 15 minut. W ten sposób będziemy gotować cytrynian sodu wraz z preparatami przez 15 minut, aby upewnić się, że preparaty nie wyschną. Będziemy monitorować preparaty, aby w przypadku wygotowania się płynu uzupełnić cytrynian sodu, zapewniając stałe nawilżenie preparatów.

Zatem przed umieszczeniem preparatów w cytrynianie sodu, podgrzałem wcześniej roztwór przez 45 sekund. Następnie umieściłem preparaty w cytrynianie sodu i teraz podgrzewam go przez 15 minut. Gdy preparaty znajdują się w roztworze, zazwyczaj zaczyna on wykipować około drugiej do drugiej i pół minuty procesu gotowania.

W tym momencie przerwę i uzupełnię ubytek cytrynianu sodu świeżym roztworem cytrynianu sodu. Po gotowaniu cytrynianu sodu przez 15 minut należy wyjąć preparaty oraz roztwór i je ochłodzić. Najlepszym sposobem na wykonanie tej czynności jest zamknięcie uchwytu do szkiełek, odlanie nadmiaru cieczy i przepłukanie go strumieniem zimnej wody, aż roztwór w słoiku ochłodzi się do temperatury pokojowej.

Zazwyczaj trwa to od 10 do 15 minut. Po wyjęciu preparatów z naczynia musimy zablokować endogenną aktywność peroksydazy w tkankach. W tym celu przygotujemy roztwór nadtlenku wodoru, wykorzystując 30% nadtlenek wodoru do przygotowania roztworu 1% nadtlenku wodoru.

Następnie przenoszę preparaty bezpośrednio do roztworu nadtlenku wodoru. Teraz inkubujemy preparaty w nadtlenku wodoru przez 20 minut. Po upływie 20 minut, po zablokowaniu peroksydazy endogennej, wypłukania nadtlenku wodoru z preparatów za pomocą przemyć z PBS.

Przeniosę teraz preparaty na prowadnicę i przemyję je trzykrotnie, wykonując trzy płukania po 5 minut każde. Preparaty zostały ułożone tyłem do siebie, aby uniknąć kontaktu z innymi szkiełkami, co mogłoby uszkodzić tkankę. Delikatnie wysuwam preparaty i układam je w taki sposób, aby tkanka nie miała możliwości kontaktu ze szkłem.

Następnie przenosimy preparaty do PBS. Po przemyciu preparatów PBS-em, teraz zablokuję nieswoiste wiązanie białek za pomocą roztworu 5% BSA, 5% surowicy koziej oraz 0,1% azotku sodu. Jeśli pracujesz z przeciwciałami kozimi, należy zastąpić surowicę kozią surowicą innego gatunku.

W tej chwili umieszczę preparaty w uchwycie do szkiełek i wypełnię go roztworem. Zazwyczaj wypełniam go do połowy, aby objętość cieczy zapewniła całkowite zanurzenie tkanek. Należy zwrócić uwagę, aby podczas umieszczania szkiełek w pojemniku tkanki nie dotykały jego ścianek.

W przypadku ostatniego slajdu, obróć go do wewnątrz, aby tkanka nie dotykała pojemnika. Po całonocnym blokowaniu slajdów, wypłukuję nadmiar roztworu blokującego, wykonując trzy pięciominutowe płukania w PBS. Na tym etapie należy obrysować tkankę okręgiem z blokera w płynie, aby zminimalizować ilość zużytego przeciwciała.

Jeśli nie muszą Państwo oszczędzać przeciwciał, można inkubować preparaty na szkiełkach w tych samych kasetkach, w których przeprowadzono etap blokowania. Od tego momentu pokażę, jak obrysować tkankę blokerem w płynie. Najpierw usuwamy nadmiar cieczy, uważając, aby nie dotknąć tkanki.

Należy przetrzeć narożniki, aby usunąć nadmiar cieczy. Ponownie, zachowując ogromną ostrożność, aby nie dotknąć tkanki. Należy wziąć pin blokujący ciecz, lekko go nacisnąć, aby uruchomić przepływ, a następnie obrysować tkankę pisakiem.

Pozostaw blokery w płynie do wyschnięcia przez około 15 sekund. Na tym etapie należy dodać przeciwciało pierwszorzędowe. Za pomocą pipety pokryj tkankę przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie przenieś ją do komory z kontrolowaną wilgotnością.

Używamy chusteczki Kimwipe, którą zwilżyliśmy wodą destylowaną w tym pudełku, aby zapobiec wysychaniu preparatu podczas inkubacji z przeciwciałem pierwotnym. Po godzinie inkubacji przeciwciała pierwotnego wyjmujemy preparaty i wypłukujemy nadmiar przeciwciał za pomocą PBS.

Ponownie należy odczekać, aż ciecz spłynie, a następnie umieścić próbkę w roztworze PBS do płukania. Ponownie płuczemy trzy razy po pięć minut. Po trzech pięciominutowych płukaniach dodamy przeciwciało wtórne do tkanki w ten sam sposób, w jaki dodawaliśmy przeciwciało pierwotne.

Używając objętości wystarczającej do pokrycia tkanek, dodaj przeciwciało wtórne – w tym przypadku stosujemy przeciwciało kozie anty-królicze – a następnie przenieś preparat z powrotem do komory z kontrolowaną wilgotnością. Stosujemy przeciwciało wtórne, biotynylowane przeciwciało kozie anty-królicze, które jest niezbędne przy zastosowaniu metody ABC. Przenosimy zatem preparat do komory z kontrolowaną wilgotnością i pozostawiamy do inkubacji przez jedną godzinę.

W czasie inkubacji przeciwciała wtórnego należy przygotować odczynnik ABC. Wykorzystujemy odczynnik A, B, C firmy Vector Laboratories z zestawu Vector Stain. Należy wyjąć odczynnik A, przygotować go do użycia, a następnie nanieść trzy krople do 15 mL PBS, uważając, aby nie ściskać probówki, ponieważ krople muszą być precyzyjnie odmierzone i mieć określoną wielkość.

Po inkubacji przeciwciała wtórnego przez około godzinę, należy wziąć preparaty i ponownie przemyć je w PBS, tak jak w przypadku przeciwciała pierwotnego. Po trzech przemyciach, z których każde trwało pięć minut, przenosi się preparaty do pojemnika, do którego dodaje się odczynnik ABC, przygotowany od 30 do 45 minut wcześniej. Należy dodać odczynnik ABC do pojemnika, tak aby całkowicie przykrył preparaty, i pozostawić je do inkubacji przez kolejne 30 do 45 minut.

Po inkubowaniu preparatów w roztworze A, B, C przez około 3-5 minut, należy wypłukać nadmiar tego roztworu. W tym celu wyjmuje się preparaty i przenosi je do roztworu PBS. Tę procedurę płukania w PBS należy powtórzyć trzykrotnie, wykonując każde płukanie przez 5 minut.

Podczas płukania szkiełek przygotowuję podłoże peroksydazy DAB firmy Vector Laboratories. Pobieram bufor o pH 7,5 i dodaję dwie krople. Następnie pobieram odczynnik substratu DAB i dodaję dwie krople tego preparatu.

Ponownie podkreślam, że wielkość kropli jest kluczowa, dlatego nie ściskaj butelki, lecz pozwól kroplom swobodnie spadać. Dwie krople dla buforu o pH 7,5. Następnie należy dodać cztery krople odczynnika substratu DAB, również pozwalając im swobodnie spaść.

Na koniec należy dodać dwie krople odczynnika substratu nadtlenku wodoru. Tak powinna wyglądać mieszanina odczynnika substratu DAB. Teraz jest ona gotowa do naniesienia na preparaty; wyjmij slajdy i pozwól, aby PBS po prostu spłynął z ich powierzchni.

Z czasem odczynnik DAB staje się coraz bardziej brązowy. W tym momencie należy go dodać do preparatów. Należy pobrać objętość wystarczającą do pokrycia tkanek i nanieść ją bezpośrednio na próbki tkanek.

Należy pobrać odpowiednią objętość i dodać ją bezpośrednio na próbki tkanek, a następnie odczekać, aż roztwór zadziała; z czasem próbki tkanek powinny przybrać brązowy kolor. Po dodaniu roztworu DAB można zauważyć na tym przekroju mózgu, że tkanka brązowieje w tym oraz w tym miejscu. Brązowe barwienie DAB ujawnia obszar zawierający dopaminergiczne neurony śródmózgowia.

Po wywoływaniu preparatów przez okres od 2 do 10 minut, należy przenieść je do lodowatej wody w celu zatrzymania reakcji. Odcedź roztwór i włóż preparaty bezpośrednio do lodowatej wody. Po zanurzeniu preparatów w lodowatej wodzie przenieś kąpiel do zlewu i płucz ją zimną wodą przez około pięć minut, aby upewnić się, że cały roztwór DAB został całkowicie usunięty z kąpieli.

Podczas mycia w zlewie należy uważać, aby strumień wody nie uderzał bezpośrednio w tkankę, lecz w jeden z rogów naczynia, pozwalając wodzie swobodnie przelewać się przez próbki; dzięki temu tkanki nie zostaną uszkodzone przez nurt wody. Po wyjęciu preparatów z kąpieli należy przeprowadzić przeciwbarwienie. Dlaczego zatem może być ono konieczne?

Jednym z powodów jest chęć zobaczenia struktury tkanki. Innym jest wizualizacja wszystkich komórek. W naszym przypadku zastosujemy przeciwbarwienie hematoksyliną, która barwi jądra komórkowe.

W tym kroku należy wziąć preparaty, usunąć nadmiar cieczy i zanurzyć je jednorazowo w roztworze hematyny. Następnie należy je wyjąć i przenieść bezpośrednio do wody. Po umieszczeniu preparatów w wodzie z kranu, należy je płukać pod strumieniem wody, podobnie jak robiono to wcześniej w kąpieli z lodowatej wody.

W przypadku płukania z hematyliny wystarczy pozostawić preparaty pod bieżącą wodą, aż woda w słoju stanie się przejrzysta. Po wyjęciu z wody barwionych kontrastowo preparatów należy je ponownie odwodnić. W tym celu przeprowadzamy je przez gradient etanolu, ale w kolejności odwrotnej.

Procedura obejmuje jedno płukanie wodą dejonizowaną, jedno płukanie w 30% etanolu, jedno płukanie w 50% etanolu, jedno płukanie w 70% etanolu, dwa płukania w 95% etanolu oraz dwa płukania w 100% etanolu, przy czym każde płukanie trwa dwie minuty. Należy wyjąć preparaty, odsączyć nadmiar cieczy, umieścić je bezpośrednio w 30% etanolu i pozostawić na dwie minuty. Po ostatnim płukaniu w 100% etanolu preparaty należy ponownie umieścić w ksylenie.

Ponownie weźcie preparaty, usuwając nadmiar cieczy, a następnie włóżcie je do pierwszego ksylenu na pięć minut. W ten sposób przeprowadzonych zostanie trzy kolejne płukania w ksylenie po pięć minut każde. Teraz jesteśmy gotowi do montowania preparatów.

Zazwyczaj na jedną minutę przed przygotowaniem szkiełek pobieram pipetą Pasteura medium do montażu permanentnego i odstawiam je mniej więcej na minutę, aż szkiełka będą gotowe do wyjęcia. Po ostatnim przemyciu ksylenem, uważając, aby nie zanurzyć rękawiczek ani nie zamoczyć ich ksylenem, wyjmij szkiełka pęsetą, zwracając uwagę, na której stronie znajduje się tkanka. Delikatnie usuń nadmiar ksylenu chusteczką Kim, uważając, aby nie dotknąć tkanki – przecieraj ostrożnie jedynie narożniki i krawędzie, pozwalając większości ksylenu odparować. Prawdopodobnie zdążysz opracować dwa szkiełka, zanim pierwsze z nich wyschnie.

Gdy osuszą się już preparaty na jednym szkiełku, drugie powinno być gotowe do dalszej pracy. Należy teraz przystąpić do dalszych czynności, zanim całkowicie wyschną. Należy nanieść cienką linię medium Perimount obok tkanki, uważając, aby nie dotknąć samej tkanki.

Usuń perimount, zdejmując szkiełko nakrywkę. Przyłóż je pod kątem 45 stopni i pozwól mu powoli opaść. Następnie przesuń szkiełko nakrywkę, upewniając się, że perimount pokrywa wszystkie tkanki.

Następnie połóż go i delikatnie naciśnij w centralnej części, aby usunąć wszystkie nadmiarowe pęcherzyki powietrza. Pozostaw do wyschnięcia podczas pracy nad drugą próbką tkanki; nie jest to jeszcze czas na oglądanie preparatów. Należy pozwolić, aby środek PermaMount wyschnął przez noc przed analizą preparatów.

W przeciwnym razie, pod światłem mikroskopu, medium do trwałego montowania utworzy pęcherzyki powietrza, co doprowadzi do zniszczenia próbki. Oto nasze przekroje mózgu po barwieniu odczynnikami chemicznymi oraz króliczym przeciwciałem poliklonalnym przeciwko tyrozynohydroksylazie. Ponownie, brązowe barwienie DAB wskazuje lokalizację dopaminergicznych neuronów śródmózgowia.

Barwienie kontrastowe hematyną zabarwia wszystkie jądra komórkowe w tej tkance na kolor niebieski. Przedstawiłam zatem sposób barwienia przekrojów zatopionych w parafinie przy użyciu zestawu ABC firmy Vector Laboratories. Teraz należy dostosować warunki do rodzajów tkanek, które będą barwione, oraz stosowanych przeciwciał.

Życzymy zatem powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.