Wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów z wykorzystaniem zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ

Ogólnym celem tej procedury jest mapowanie sond DNA na politenicznych chromosomach komara z wykorzystaniem preparatyki chromosomów pod wysokim ciśnieniem, a następnie zautomatyzowanej hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ oraz zautomatyzowanego obrazowania. Cel ten osiąga się poprzez wstępne przygotowanie preparatów chromosomów politenicznych metodą wysokociśnieniową. Kolejnym krokiem procedury jest przygotowanie sond fluorescencyjnych poprzez znakowanie genomicznego DNA bakteryjnego fluorochromem z wykorzystaniem protokołu translacji nacięć (Nick translation).

Trzecim krokiem jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej przy użyciu zautomatyzowanych systemów barwienia preparatów. Ostatnim etapem jest skanowanie i fotografowanie znakowanych chromosomów za pomocą automatycznego systemu obrazowania fluorescencyjnego. W rezultacie obrazy mogą ukazać lokalizację fluorescencyjnie znakowanej sondy DNA na polichromosomie.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowy ręczny protokół hybrydyzacji in situ, jest to, że protokół mapowania fizycznego o wysokiej przepustowości zapewnia bardziej spójne wyniki i drastycznie skraca czas pracy manualnej. Protokół ten rozpoczyna się od sekcji samic o połowie grawitacji i oly około 25 godzin po żerowaniu na krwi, aby zebrać ich jajniki w stadium trzecim według klasyfikacji Christophera. Na tym etapie przezroczysty obszar z komórkami pielęgnującymi wewnątrz pęcherzyków powinien mieć okrągły kształt; należy zebrać jajniki od pięciu samic i utrwalić je w 500 µL świeżo przygotowanego zmodyfikowanego roztworu Carnoya.

Następnie można je przechowywać w temperaturze pokojowej do 24 godzin lub dłużej w temperaturze -20 °C. Przed przygotowaniem preparatów do sekcji jajników należy przygotować roztwór Carnoy'a oraz 50% kwas propionowy. Każdą parę jajników należy umieścić w kropli świeżego roztworu Carnoy'a na czystym szkiełku przedmiotowym pod mikroskopem sekcyjnym.

Rozdziel jajniki za pomocą igły sekcyjnej. Przenieś wszystkie fragmenty jajnika na sześć czystych szkiełek z 50% kwasem propionowym. Oddziel od siebie pęcherzyki za pomocą igieł sekcyjnych.

Następnie usuń pozostałe tkanki za pomocą ręcznika papierowego. Dodaj kolejną kroplę 50% kwasu propionowego i odczekaj od trzech do pięciu minut. Zgodnie z legendą, pozostawienie mieszków w 50% kwasie propionowym na trzy do pięciu minut znacząco poprawia rozprzestrzenienie chromosomów.

Następnie nałóż szkiełko cover slip i odczekaj kolejną minutę, aby jądra komórkowe się rozprzestrzeniły. Owiń preparat papierem filtracyjnym i folią plastikową. Ustaw urządzenie Dremel na prędkość od 3 000 do 5 000 RPM i przez około jedną minutę lekko dociskaj obracającą się końcówkę Dremela do szkiełka cover slip, wykonując koliste ruchy.

Potwierdzić jakość rozprzestrzenienia pod mikroskopem fazowym i w razie potrzeby dłużej stosować dremel, aby spłaszczyć chromosomy. Umieścić drugie szkiełko zakrywające obok pierwszego, a następnie złożyć szkiełka zakrywające za pomocą innego mikroskopu. Następnie owinąć preparaty arkuszem plastiku oraz papierem filtracyjnym, a następnie umieścić owinięte preparaty w imadle, aby ścisnąć je z siłą od 85 do 120 cali-funtów.

Po spłaszczeniu chromosomów na wszystkich sześciu szkiełkach, rozwiń je i usuń dodatkowe szkiełka, aby dalej spłaszczyć chromosomy. Inkubuj szkiełka w temperaturze 55 °C przez 10 do 15 minut w systemie do denaturacji i hybrydyzacji szkiełek. Następnie zanurz szkiełko w ciekłym azocie na co najmniej 15 sekund lub do momentu ustąpienia pęcherzyków.

Następnie szybko usuń szkiełko nakrywkę za pomocą żyletki i niezwłocznie umieść preparat w zimnym 50% etanolu na pięć minut. Powtórz ten proces dla każdego preparatu sekwencyjnie. Odwodnij preparaty w kąpielach z 70%, 90% oraz 100% etanolu.

Zanurz je w każdej kąpieli na pięć minut. Na koniec, po wyschnięciu preparatów na powietrzu, są one gotowe do barwienia. Automatyczne urządzenie wykonuje większość etapów procedury, z wyjątkiem znakowania sondy.

Przed załadowaniem urządzenia należy przygotować sondę fluorescencyjną poprzez znakowanie DNA wstecznego fluorochromem, korzystając z komercyjnego protokołu translacji NIC. Po przygotowaniu sondy należy umieścić slajdy i odczynniki w zautomatyzowanym systemie barwienia slajdów i zaprogramować system do wykonania następujących kroków. W pierwszej kolejności należy podać 800 µL 1x PBS przez 20 minut.

Po drugie, wysusz preparaty strumieniem powietrza. Po trzecie, utrwal preparaty za pomocą 450 µL 4% formaliny w 1x PBS przez jedną minutę. Następnie przemyj preparaty 100% etanolem przez jedną sekundę (dwukrotnie) oraz przez dwie minuty.

Po kąpieli w etanolu ponownie wysuszyć preparaty strumieniem powietrza. Następnie podgrzewać preparaty w temperaturze 45°C przez dwie minuty, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Potem nanieść 20 µL sondy DNA, a następnie dodać kroplę oleju mineralnego i nałożyć szkiełko nakrywkę; w dalszej kolejności denaturować chromosomy w temperaturze 90°C przez 10 minut.

Następnie pozostawcie preparaty do hybrydyzacji w temperaturze 42 °C przez 14 godzin. Po hybrydyzacji przeprowadźcie płukanie o wysokiej rygorystyczności przez dwie minuty w temperaturze 42 °C, a następnie wykonajcie cztery kolejne jednosekundowe aplikacje 2X SSC i wysuszcie preparaty. Następnie dwukrotnie zastosujcie 800 µL 0,4X SSC w temperaturze 42 °C przez 10 minut, po czym wykonajcie jeszcze jedno płukanie oraz zastosujcie 2X SSC w temperaturze 25 °C przez 10 minut.

Następnie nanieś barwnik: 50 µL YO-YO-1, a następnie olej mineralny i szkiełka nakrywkowe. Inkubuj preparaty w temperaturze 25 °C przez 10 minut. Następnie zdejmij szkiełka nakrywkowe.

Przemyj preparaty czterokrotnie w roztworze two XSSC przez jedną sekundę podczas każdego płukania, a następnie osusz je strumieniem powietrza. Na koniec nanieś 15 µL odczynnika Prolonged Gold Anti-Fade na każdy preparat i nałóż nowe szkiełka nakrywkowe. Włącz zautomatyzowany system skanowania Accord plus, zaczynając od zasilacza Olympus U-R-F-L-T dla żarówki halogenowej.

Następnie komputer, a na koniec mikroskop z dołączoną kamerą. Teraz w pierwszej kolejności uruchom pakiet oprogramowania duet, a następnie ustaw wstępne skanowanie 10 x. Kliknij przycisk online, wprowadź nowy identyfikator przypadku (case ID) i przypisz identyfikator preparatu (slide id).

Kliknij punkt oznaczony jako bf. Jest to opcja jasnego pola. Wybierz opcję skanowania 10 x pre-scan.

Wybierz opcję 2 500 x circle, 10 000 x circle lub rectangle. Kliknij set and run. Następnie postępuj zgodnie z komunikatami, aby odpowiednio dostosować skanowanie, a następnie kliknij finish.

Aby rozpocząć skanowanie, naciśnij główną kartę, aby wrócić do ekranu głównego. Następnie kliknij przycisk offline, znajdź przypisane ID przypadku oraz ID slajdu, a potem kliknij offline.

Zeskanuj obszar czarnej skrzynki w lewym górnym rogu. Kliknij strzałkę i wybierz opcję 10 x pre-scan. Po znalezieniu interesującego obrazu użyj strzałek, aby przejrzeć przeskanowane obrazy.

Kliknij dwukrotnie na ekranie w środku docelowego obszaru i naciśnij przycisk snap. Pozwoli to wyznaczyć obraz do późniejszego zarejestrowania, po wybraniu wszystkich celów. Kliknij prawym przyciskiem myszy na każdym obrazie, wybierz classify, zaznacz 10 x pre-scan oraz wybierz polytan.

Powróć do menu głównego i skonfiguruj skan wstępny 40x. Ponownie wybierz opcję online i wybierz preparat. Zmień BF na ffl oraz zmień nazwę zadania na revisit dash X 40 dash rg.

Zmień sekcję znajdującą się bezpośrednio pod ostatnim ustawieniem na revisit dash all. Następnie uruchom program i postępuj zgodnie z instrukcjami. Aby skonfigurować automatyzację, kliknij przycisk start matching views, aby dopasować obrazy 10 x i 40 x.

Kliknij „finish”, aby rozpocząć skanowanie. Po zakończeniu kliknij „classify” i przejrzyj obrazy. Preparaty politenicznych chromosomów komórek pielęgnujących jajnika od samic anomaly Gambia zostały wykonane przy użyciu techniki wysokociśnieniowej.

Ta metoda nie uszkadza ani nie zmienia większości struktur chromosomowych. Prostuje ona zagięte chromosomy, co pozwala na ujawnienie ukrytych, cienkich prążków, których nie widać w standardowych preparatach. Chromosom poddano hybrydyzacji z klonami DNA z biblioteki bakteryjnej anomaly S Gambia nd Tam.

Bibliotekę przygotowano z samców i samic larw w stadium pierwszej gwiazdy szkodnika z anomalii S Gambia. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać zautomatyzowane wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne w celu ułatwienia szybkiego opracowania asemblacji genomu opartych na chromosomach.