Retrogradne znakowanie nerwów, szlaków i korzeni rdzeniowych barwnikami fluorescencyjnymi

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie wysokiego stężenia barwnika fluorescencyjnego lub czułego na jony do neuronów lub dowolnego szlaku neuronalnego przy użyciu prostej i taniej techniki. Osiąga się to poprzez wstępne wykonanie dwóch rodzajów pipet: typu pierwszego i typu drugiego. Następnie do pipety typu pierwszego podłącza się elastyczną rurkę elastomerową i przykłada nadciśnienie, aby zassać docelowy szlak neuronalny do wnętrza pipety typu pierwszego, upewniając się przy tym, że uzyskano szczelne połączenie.

Następnie włożyć pipetę typu dwa do pipety typu jeden i za pomocą pipety typu dwa odessać pozostały A CSF z pipety typu jeden. Następnie wprowadzić barwnik do pipety typu jeden, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Ostatnim krokiem jest inkubacja neuronów w ciemności przez okres od 6 do 20 godzin.

Ostatecznie, po usunięciu pipety typu pierwszego, preparat jest gotowy do badań in vitro, elektrofizjologicznych lub morfologicznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak aplikacja kąpielowa, wstrzykiwanie BOS i elektroporacja, jest dostarczenie D do określonej populacji neuronów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, dotyczące m.in. aktywności, łączności, morfologii i rozmieszczenia określonych neuronów.

Zasadniczo technika ta wymaga wprawy, w szczególności w zakresie zapewnienia, aby barwnik nie uległ rozcieńczeniu w pipecie typu pierwszego i aby do jej wnętrza nie dostały się pęcherzyki powietrza. Należy rozpocząć tę procedurę od wyciągnięcia rurki polietylenowej nad płomieniem lampy alkoholowej, aby uzyskać dwie krótkie pipety o zwężonych końcach. W pierwszej kolejności należy wyciągnąć krótką pipetę typu pierwszego z małą końcówką, która będzie w stanie ściśle utrzymać docelowy korzeń lub trakt.

Następnie należy pobrać pipetę typu dwa z dłuższym, cieńszym trzoniem i bardzo cienką końcówką, którą można wsunąć do pipety typu jeden aż do jej wierzchołka. Następnie pipetę typu dwa należy połączyć z igłą 19 gauge zamocowaną do EC. Po tym czasie wyizolowany rdzeń kręgowy należy umieścić w kąpieli.

Przez cały proces ładowania należy przemywać go schłodzonym A CSF. Następnie należy umieścić pipetę typu jeden w uchwycie do elektrod w taki sposób, aby jej tylny otwór można było łatwo połączyć z strzykawką za pomocą elastycznego przewodu. W tej procedurze najpierw należy zaciągnąć A CSF do pipety typu jeden za pomocą strzykawki.

Następnie narysuj trakt aksonalny lub korzeń, który ma zostać wypełniony. Potem usuń elastyczny przewód z tylnego otworu. Po tym kroku podłącz pipetę typu dwa do kolejnej strzykawki.

Wprowadź ją do pipety typu jeden, która utrzymuje trakt aksonalny lub korzeń neuronowy pod mikroskopem. Użyj strzykawki przymocowanej do pipety typu dwa, aby odessać A CSF w taki sposób, by pozostałe A CSF ledwo pokrywało trakt aksonalny. Następnie wycofaj pipetę typu dwa z pipety typu jeden.

Monitoruj poziom A CSF przez kilka minut, aby zweryfikować szczelność drogi aksonalnej lub nerwów. Następnie rozpuść barwnik w A CSF lub 0,2% Triton X 100 w wodzie dwukrotnie destylowanej. Pobierz go do pipety typu dwa, wywierając słabe podciśnienie za pomocą dołączonej strzykawki, uważając przy tym, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.

Następnie wprowadź pipetę typu dwa zawierającą barwnik do pozostałego roztworu A CSF. W pipecie typu jeden powoli uwolnij barwnik do A CSF, stosując delikatne dodatnie ciśnienie za pomocą strzykawki. Należy upewnić się, że do środka nie dostały się pęcherzyki powietrza i że tkanka docelowa nie została przesunięta z wnętrza końcówki. Jeśli podczas wstrzykiwania barwnika do pipety typu jeden dostanie się pęcherzyk powietrza, należy go usunąć, zbliżając końcówkę pipety typu dwa do pęcherzyka, a następnie delikatnie przykładając słabe ciśnienie ujemne za pomocą dołączonej strzykawki.

Po uwolnieniu odpowiedniej ilości barwnika wyciągnij pipetę typu dwa. Następnie inkubuj tkankę w ciemności od 6 do 20 godzin, w zależności od rodzaju eksperymentu. Po upływie czasu niezbędnego do wypełnienia, ostrożnie odsuń elektrodę od tkanki.

Następnie tkanka jest gotowa do obrazowania lub badania histologicznego. Poniżej znajduje się schemat przedstawiający jednoczesne wprowadzanie trzech różnych koniugowanych fluorescencyjnych barwników dekstranowych do neuronów ruchowych, aferentnych sensorycznych oraz interneuronów rdzeniowych; neurony ruchowe oraz sakralne aferentne sensoryczne zostały wypełnione wstecznie barwnikami Cascade blue Dextran i Texas red dextran odpowiednio przez korzenie brzuszne i grzbietowe. Zielony fluorescencyjny dekstran został wprowadzony do interneuronów rdzeniowych, których aksony biegną w górę przez sznur brzuszny.

Przedstawiono tutaj obraz konfokalny przekroju sakralnego rdzenia kręgowego, w którym neurony zostały oznakowane wstecznie. Należy zauważyć, że oznakowane włókna sensoryczne doprowadzające są głównie ipsilateralne. Poza nielicznymi projekcjami kontralateralnymi, oznakowane motoneurony znajdują się ipsilateralnie względem wypełnionego korzenia brzusznego, podczas gdy oznakowane interneurony są względem niego kontralateralne, co wskazuje grot strzałki.

Po wykonaniu tej procedury można zastosować dodatkowe metody w celu udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące m.in. łączności funkcjonalnej, równowagi pobudzającej i hamującej, typu zatoki, rozmieszczenia oraz produkcji neuroprzekaźników w neuronach pola DI. Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu neurofizjologii rdzenia kręgowego i pnia mózgu do wyodrębniania specyficznych populacji neuronalnych przy użyciu barwników wrażliwych na jony. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu wprowadzania barwników fluorescencyjnych i/lub wrażliwych na jony do neuronów i włókien sensorycznych w izolowanym rdzeniu kręgowym.