Ocena replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach gryzoni poddanych transdukcji adenowirusowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie szlaków sygnalizacyjnych regulujących zmiany w funkcjonalnej masie komórek beta. Jest to realizowane w izolowanych wywojowniczkach szczura poprzez nadekspresję lub supresję ekspresji genu z wykorzystaniem wektorów adenowirusowych. Po tej manipulacji funkcję komórek beta ocenia się na podstawie wydzielania insuliny, a replikację wywojowniczek poprzez pomiar wbudowywania trytyzowanej tymydyny.

W ostateczności testy te mogą wykazać, czy badany gen reguluje proliferację i/lub funkcję komórek beta in vitro. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii powiek, takie jak: czy konkretny składnik szlaku sygnalizacyjnego wpływa na wzrost i funkcję komórek beta? Przygotuj sześciodołkową płytkę bez powłoki do hodowli tkankowej, dodając 2 mL zmodyfikowanego medium do wymaganej liczby dołków.

Na przykład typowy eksperyment może wymagać trzech dołków: jednego dla kontroli bez wirusa, jednego dla kontroli z wirusem oraz jednego dla grupy eksperymentalnej; ogrzewaj płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowej przez co najmniej 30 minut. Bezpośrednio po izolacji soczewek szczurzych umieść od 1 do 200 soczewek w każdym dołku przygotowanej płytki. 60 soczewek zostanie wykorzystanych do analiz biochemicznych, a pozostałe soczewki można wykorzystać do badań ekspresji genów lub immunoblotingu; delikatnie zakołysz płytką, aby przenieść soczewki na środek każdego dołka.

Następnie niezwłocznie nanieś pipetą adenowirusa bezpośrednio na oczka, na środku szalki. Zastosuj wielokrotność infekcji (MOI) od 1 do 500, w zależności od skuteczności adenowirusa w nadekspresji lub wyciszaniu badanego białka.

Efektywna penetracja adenowirusa do rdzenia powieki zwiększa powtarzalność wyników. Kluczowe jest przeprowadzenie transdukcji powiek bezpośrednio po ich izolacji.

Nie niepokoić płytki przez pięć minut, a następnie przenieść ją do inkubatora na 24 godziny. Następnego dnia wyjąć płytkę z inkubatora i delikatnie przesunąć wycinki tkanek (eyelets) do centrów studni. Przenieść wycinki do nowej studni zawierającej świeżą pożywkę, używając mikropipety o objętości 200 µL.

Jeśli oczka przykleją się do płytki, można je delikatnie odczepić za pomocą końcówki pipety. Pomocne jest użycie wirusa kontrolnego wykazującego GFP w celu weryfikacji odpowiedniej wydajności transdukcji poprzez zastosowanie mikroskopii konfokalnej do wizualizacji penetracji adenowirusa do wnętrza hodowli wysepek. Przechowywać wyspki przez jeden do trzech kolejnych dni, codziennie wymieniając pożywkę.

Czas hodowli musi zostać zoptymalizowany w badaniach pilotażowych i różni się w zależności od celów eksperymentalnych. W ciągu ostatnich 24 godzin należy dodać do pożywki tymidynę trytowaną w stężeniu 1 µCi/ml pożywki. Najpierw należy przygotować 50 ml świeżego SAB roboczego w probówce stożkowej o pojemności 50 ml i ogrzać go w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.

Pipetować 10 mililitrów roboczego SAB do 15 mililitrowej probówki stożkowej i dodać 66,8 mikrolitrów 2,5 molarnej D-glukozy. Aby przygotować SAB o wysokiej zawartości glukozy, dodać 44,8 mikrolitrów 2,5 molarnej D-glukozy do pozostałych 40 mililitrów roboczego SAB. Aby przygotować SAB o niskiej zawartości glukozy, należy następnie oznakować trzy 1,7 mililitrowe probówki do mikrocentryfugi.

Do każdej studzienki płytki 6-dołkowej dodaj 1 ml PBS. Pamiętaj o przestrzeganiu protokołów instytucjonalnych dotyczących obchodzenia się z radioaktywnymi gałkami ocznymi i ich utylizacji. Używając stereomikroskopu lub standardowego mikroskopu, wybierz i przenieś 20 gałek ocznych o zbliżonej wielkości do każdej probówki do mikrocentryfugi.

Na przykład każda probówka może zawierać pięć małych, 10 średnich i pięć dużych oczek. Chociaż wyniki są normalizowane do całkowitej zawartości białka na koniec eksperymentu, kluczowe jest dopasowanie wielkości oczek pomiędzy grupami. Po pozwoleniu oczkom na osadzenie się na dnie probówki pod wpływem grawitacji lub wirowania, należy odessać i zważyć PBS za pomocą mikropipety, a następnie przystąpić do przygotowania oczek do analiz biochemicznych.

Aby przygotować wysepki do analizy wydzielania insuliny, należy je najpierw poddać preinkubacji w pożywce SAB z niską zawartością glukozy. W tym celu do probówek należy dodać 400 µL pożywki SAB z niską zawartością glukozy, a następnie umieścić je z zakrętkami w inkubatorze do hodowli tkankowych na 60 minut. Po godzinie należy odessać pożywkę SAB z niską zawartością glukozy użytą do preinkubacji. Aby zmierzyć podstawowe wydzielanie insuliny, należy powtórzyć procedurę preinkubacji.

Aby jednak zmierzyć stymulowaną sekrecję insuliny, należy użyć 400 µL SAB z wysoką zawartością glukozy zamiast SAB z niską zawartością glukozy i, podobnie jak wcześniej, inkubować wysepki przez 60 minut. Po inkubacji w SAB z wysoką lub niską zawartością glukozy należy odessać SAB i pobrać próbkę do radioimmunologicznego testu insuliny, który zostanie przeprowadzony zgodnie z protokołem producenta. Następnie należy przejść do testu wbudowywania tymidyny, wykorzystując ten sam zestaw wysepek. Rozpocząć należy od wysepek, które zostały właśnie użyte do testu sekrecji insuliny.

Dodaj 1 ml PBS i pozwól oczkom opaść pod wpływem grawitacji. Następnie odessij PBS za pomocą mikropipety. Wylej roztwór i powtórz ten krok jeszcze raz.

Następnie do oczków dodaj 500 µL schłodzonego w lodzie kwasu trójchlorooctowego i inkubuj je w lodzie przez 30 minut. Odwiruj próbki w wirowce w temperaturze 4 °C. Następnie odessij i usuń TCA.

Następnie należy dodać 80 µL 0,3 N wodorotlenku sodu i inkubować wycinki oka przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji próbki należy energicznie mieszać w wstrząsarku wirówkowym przez 5 do 10 sekund co 10 minut. Równolegle do probówek do cieczoscintylacyjnego zliczania o pojemności 7 mL należy dodać 4 mL koktajlu zliczającego Conno Safe.

Po zakończeniu inkubacji oczek, przenieś 50 µL zawiesiny oczek do probówki scyntylacyjnej. Krótko wstrząśnij zamkniętą probówką, a następnie zmierz radioaktywność próbek w cieczowym liczniku scyntylacyjnym. Aby zmierzyć stężenie białka, przenieś 10 µL zawiesiny do komercyjnego zestawu do oznaczania kwasu bionicznego i postępuj zgodnie z protokołem producenta.

Następnie, podczas analizy danych, znormalizuj wyniki względem stężenia białek, korzystając z opisanych protokołów. Replikacja wysepek i funkcja komórek beta. W wysepkach szczurzych oceniono, że adenowirusowa nadekspresja hipotetycznego genu six silnie stymulowała replikację wysepek, nie zmieniając funkcji komórek beta.

Zwiększona ekspresja genu six spowodowała wzrost syntezy DNA, zmierzony poprzez wbudowywanie tymidyny, ponieważ większość komórek w wyspach trzustki szczura to komórki beta. Dalsze eksperymenty mogłyby wykazać, że ten wzrost wbudowywania tymidyny wynika ze zwiększonej replikacji komórek beta. Test wydzielania insuliny wykazał, że nadekspresja genu six nie zmieniła jednej z głównych funkcji komórek beta, jaką jest wydzielanie insuliny przy niskim i wysokim stężeniu glukozy.

Wzrost wydzielania insuliny przy niskich i wysokich stężeniach glukozy odzwierciedla stan wysp trzustkowych po leczeniu adenowirusem. Gdyby zwiększenie ekspresji genu sześć upośledzało funkcję komórek beta, prawdopodobnie objawiłoby się to spadkiem poziomu insuliny wydzielanej przy wysokich, stymulujących stężeniach glukozy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób pomiaru replikacji komórek beta oraz wydzielania insuliny w celu ustalenia, czy konkretny gen wpływa na wzrost lub funkcję komórek beta.