Metoda genotypowania oparta na PCR do rozróżniania odmian dzikich i ozdobnych Imperata cylindrica

Głównym celem niniejszej procedury jest zapewnienie kosztowo efektywnego i szybkiego protokołu genotypowania molekularnego, który pozwala na rozróżnienie odmian Retta cylindrica, powszechnie nazywanej trawą gon, których nie można odróżnić wyłącznie na podstawie morfologii. Osiąga się to poprzez uprzednią identyfikację i izolację tkanki z interesującej odmiany trawy gon. Kolejnym krokiem jest ekstrakcja DNA jądrowego i plazmidowego z pobranej tkanki.

Następnie przeprowadza się reakcję łańcuchową polimerazy na wyekstrahowanym DNA, wykorzystując primery specyficzne dla danej odmiany, które celują w różnice sekwencji w regionie PLAs turn LF, a także odpowiednie kontrole pozytywne i negatywne. Ostatnim krokiem jest wykonanie elektroforezy żelowej dla każdej z czterech reakcji PCR w celu wizualizacji amplifikowanych produktów PCR. Ostatecznie odmiana zebranego trawy gon określa się poprzez analizę wynikowych prążków produktów PCR specyficznych dla odmiany na żelu. Gatunki inwazyjne kosztują Stany Zjednoczone około 3,4 miliarda rocznie, wyrządzając znaczne szkody zarówno w zasobach rolniczych, jak i naturalnych.

Dziki typ Imperata cylindrica, znany również jako trawa Cogana, znajduje się wśród 10 najgroźniejszych inwazyjnych chwastów na świecie. Trawa Cogana szybko rozprzestrzenia się, tworząc monokultury, które wypierają rodzimą roślinność, a w konsekwencji zwierzęta zależne od tej roślinności. Trawa ta zajmuje obecnie 490 milionów hektarów na całym świecie i około 500 000 hektarów w Stanach Zjednoczonych. Odmiana ozdobna Imperata cylindrica jest szeroko sprzedawana pod nazwami Imperata cylindrica, Arbra, Red Baron oraz Japanese Blood Grass, którą będziemy nazywać JBG. Odmiana ta jest prawdopodobnie sterylna i nieinwazyjna i jest ceniona ze względu na czerwone liście.

W określonych warunkach japońska trawa krwawa może wytwarzać zdolne do kiełkowania nasiona i powrócić do formy całkowicie zielonej, nieodróżnialnej od dzikiego typu trawy cogan. Jak widać, obie posiadają zielone liście i są większe niż tradycyjna odmiana ozdobna, charakteryzując się większymi liśćmi. Dodatkowo, rośliny powrócone do formy pierwotnej oraz dziki typ mają większe kłącza, co zwiększa ich potencjał rozmnażania bezpłciowego w porównaniu z odmianą ozdobną.

Powrót do pierwotnych cech sprawia, że identyfikacja oparta wyłącznie na morfologii staje się trudnym zadaniem. Metody molekularne umożliwiają dokładne rozróżnienie inwazyjnych roślin oraz materiałów roślinnych, których nie można zidentyfikować za pomocą standardowych metod wizualnych.

Metody molekularne są kluczowe w zapobieganiu rozprzestrzenianiu się i wprowadzaniu roślin inwazyjnych. Zastosowanie niniejszego protokołu molekularnego umożliwia dokładne odróżnienie osobników powrotnych japońskiej trawy krwawiącej od trawy Kogana. Protokół ten może pomóc zapobiec współwystępowaniu z trawą Kogana oraz możliwemu powstawaniu żywotnych hybryd.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów (AFLP) czy sekwencjonowanie DNA, jest fakt, że stanowi ona bardzo kosztowo efektywną i szybką metodę genotypowania molekularnego, która pozwala z łatwością odróżnić trawę kogan typu dzikiego od odmian japońskiej trawy krwawiącej. Technikę zaprezentuje Joseph Hery, student z naszego laboratorium. Najpierw należy zidentyfikować okaz z miejsca, w którym rosną trawa kogan lub japońska trawa krwawiąca i konieczne jest ich rozróżnienie.

Japońska trawa krwawa jest łatwo odróżnialna od dzikiego typu trawy Kogan dzięki jaskrawoczerwonym liściom. Jednak powrót do typu dzikiego u japońskiej trawy krwawej jest niemal niedośróżnialny od trawy Kogan, ponieważ obie mają dłuższe zielone liście, większą powierzchnię liści oraz większe kłącza niż ozdobna japońska trawa krwawa. Niniejsza metoda może być stosowana do świeżych, zamrożonych i niedawno wysuszonych tkanek liści.

W przypadku przechowywania tkanek do późniejszej ekstrakcji DNA najlepszą metodą jest ich natychmiastowe zamrożenie i przechowywanie w temperaturze minus 80 °C. Jeśli wymagane jest przechowywanie na sucho, należy umieścić tkankę w papierowej kopercie, a następnie przechowywać kopertę w odwodnionym żelu krzemionkowym lub innych aktywnych środkach osuszających w temperaturze pokojowej. W przypadku użycia świeżej tkanki należy upewnić się, że ekstrakcja DNA zostanie przeprowadzona w ciągu trzech godzin od pobrania, aby zapobiec degradacji.

W niniejszej procedurze zastosowano zestaw mini DNEZ plants firmy Kyogen zgodnie z instrukcją producenta z jedną niewielką modyfikacją. Procedura została dostosowana tak, aby wykorzystać ponad 100 mg świeżej lub zamrożonej tkanki lub ponad 20 mg tkanki wysuszonej. Najpierw należy rozetrzeć ponad 100 mg świeżego lub zamrożonego liścia lub ponad 20 mg wysuszonego liścia na drobny proszek, stosując trzykrotne schładzanie ciekłym azotem podczas rozcierania w schłodzonej moździerzu z tłuczkiem.

Odważ zamrożony proszek z tkanki świeżej lub mrożonej w ilościach 100 mg na każdą aلیکwot. W przypadku użycia suchej tkanki liściowej odważ proszek w ilościach 20 mg na każdą alikwot. Po tym kroku przeprowadź ekstrakcję DNA zgodnie z instrukcjami producenta, wykorzystując spektrofotometr, np. poprzez test spektrofotometryczny NanoDrop; dobra wydajność DNA pod względem jakości i ilości powinna wynosić od 50 do 150 ng/µl, a stosunki 260/280 oraz 230/280 powinny być bliskie wartości 2,0, jak pokazano tutaj.

Przeprowadź elektroforezę z użyciem standardowego żelu AROS 1%. Zweryfikuj obecność stosunkowo dużych prążków powyżej 10 KB z niewielkim lub żadnym smużeniem wynikającym z kontaminacji RNA; jeśli stężenie DNA jest wysokie, rozcieńcz próbki do 70 nanogramów na mikrolitr przed kolejnymi etapami. Startery PCR użyte w tym protokole, wskazane czerwonymi i zielonymi strzałkami, opierają się na różnicach sekwencji między regionem spacera LF w obrębie plastidów u genotypów Cogan grass oraz Japanese blood grass.

Różnice te występują w postaci polimorfizmów pojedynczego nukleotydu oraz insercji i delecji, wskazanych czarnymi strzałkami pionowymi, co umożliwia opracowanie starterów specyficznych dla danej odmiany. Dzięki rozmieszczeniu starterów w miejscach unikalnych sekwencji, ich sekwencje zostały zawarte w pisemnej części protokołu dla każdej wyizolowanej próbki DNA; należy przygotować dwie reakcje PCR o objętości 50 µL w 0,2 ml cienkościennych probówkach do PCR w warunkach chłodzenia (na lodzie), używając każdego zestawu starterów zgodnie z pisemnym protokołem. Jeśli stężenie DNA jest niskie, do każdej reakcji można dodać więcej DNA, korygując ilość nukleazowej, dwukrotnie destylowanej wody w taki sposób, aby całkowita objętość reakcji pozostała na poziomie 50 µL.

Należy użyć nie więcej niż pięciu mikrolitrów DNA lub 10% całkowitej objętości na jedną reakcję, ponieważ zanieczyszczenia zawarte w próbkach DNA mogą hamować reakcje PCR; aby upewnić się, że wszystkie odczynniki do PCR działają prawidłowo, należy przygotować kontrolę pozytywną. Używając starterów do kontroli pozytywnej, należy przygotować kontrolę negatywną z tym samym zestawem starterów co w kontroli pozytywnej, ale z zastosowaniem wody dwukrotnie destylowanej zamiast wyekstrahowanego DNA; w tym punkcie dla każdej badanej próbki przygotowano łącznie cztery reakcje PCR. Następnie należy przeprowadzić amplifikację PCR w termocyklerze wyposażonym w podgrzewaną pokrywę, stosując parametry cykli PCR opisane w protokole pisemnym; w zależności od jakości DNA, starterów, polimerazy Taq lub rodzaju użytego termocyklera, konieczna może być optymalizacja temperatury przyłączania starterów, czasu elongacji oraz liczby cykli.

Po zakończeniu reakcji PCR produkty PCR należy rozdzielić na żelu 1% przy użyciu standardowej elektroforezy. Próbki należy prowadzić przy napięciu około 120 V, aż front barwnika dotrze do trzech czwartych całkowitej długości żelu. Żel należy wizualizować w świetle UV i sprawdzić powstałe prążki, aby potwierdzić amplifikację odpowiedniego fragmentu DNA.

Ten reprezentatywny żel przedstawia wyniki elektroforezy produktów PCR uzyskanych z próbek DNA trawy Kogan, trawy japońskiej (Japanese blood grass) oraz trawy japońskiej revert, połączonych ze specyficznymi starterami dla trawy Kogan i JBG, a także dodatnią kontrolą turn LF i ujemną kontrolą bez matrycy. Zestaw starterów dla dodatniej kontroli turn LF działa równie skutecznie w przypadku trawy Kogan, trawy japońskiej, trawy japońskiej revert oraz innych traw, dając prążek o długości 890 par zasad. Jeśli wszystkie odczynniki do PCR są wolne od zanieczyszczeń DNA, reakcja kontrolna ujemna nie przyniesie produktu PCR.

Jeśli próbka DNA pochodzi z trawy kogan typu dzikiego, reakcja PCR z zastosowaniem zestawu starterów specyficznych dla trawy kogan spowoduje powstanie pojedynczego prążka o długości około 595 par zasad, natomiast startery specyficzne dla JBG nie wykażą żadnego prążka. Analogicznie, jeśli próbka DNA pochodzi z JBG lub z odwróconej reakcji J-B-G-A-P-C-R, zastosowanie zestawu starterów specyficznych dla JBG spowoduje powstanie pojedynczego prążka o długości około 594 par zasad, podczas gdy startery specyficzne dla trawy kogan nie wykażą żadnego prążka.

Ponieważ JBG i powrócone JBG mają identyczną sekwencję kwasów nukleinowych, będą one wykazywać identyczne wzory prążkowania. Jednak różnice morfologiczne między JBG a powrotami JBG są dość wyraźne, więc mimo że wyniki PCR będą takie same, odmiany JBG są łatwe do rozróżnienia na poziomie rośliny. Sekwencjonowanie DNA produktów PCR może pozwolić na zidentyfikowanie ewentualnych zmian w sekwencjach DNA dla różnych ekotypów trawy cogon.

Opracowanie tej techniki dostarcza pierwszej uproszczonej metody molekularnej, która pozwala na dokładne rozróżnienie między dzikim typem K and grass a formą powrotną jego odmiany ozdobnej, jaką jest Japanese blood grass. Zachęcamy użytkowników tego protokołu do kontaktu z nami w celu zgłoszenia wyników uzyskanych dzięki zastosowaniu tej procedury. Tak udostępnione dane pomogą w gromadzeniu informacji na temat rozpowszechnienia Japanese blood grass.

Pomoże to również organom regulacyjnym w USDA w podejmowaniu świadomych decyzji dotyczących działań, które mogą być niezbędne, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się i potencjalnej hybrydyzacji wysoce inwazyjnych odmian trawy Cogana.