Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja migracji dojrzałych komórek prekursorowych neuronów w obecności elektrycznego pola prądu stałego. Osiąga się to poprzez wstępną izolację i hodowlę subependymalnych komórek prekursorowych neuronów od dorosłej myszy. Kolejnym krokiem jest przygotowanie komór Galvan Axxis i przeniesienie komórek prekursorowych neuronów do tych komór.

Ostatnim krokiem jest przyłożenie pola elektrycznego prądu stałego do komory Galvan Axxis i przeprowadzenie obrazowania poksylowanego (time-lapse), aby zaobserwować migrację prekursorów neuronów. Ostatecznie mikroskopia z obrazowaniem poksylowanym pozwala uchwycić właściwości galwanotaktyczne prekursorów neuronów w ich stanach zróżnicowanych i niezróżnicowanych. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat galwanotaksji komórek prekursorowych neuronów, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak mysi model udaru, w celu zbadania rekrutacji prekursorów neuronów do miejsc uszkodzeń w celu usprawnienia neuroregeneracji.

Procedurę zademonstruje Rob Pilley Post, doktorant z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury NPC muszą pozostawać w hodowli przez siedem dni, tak aby wolno pływające pierwotne neurosfery były gotowe do zbioru. W razie potrzeby należy rozpocząć przygotowanie trzech komór Galvan Axxis, umieszczając w nich trzy kwadratowe szkiełka.

Po pierwsze, szkiełka nakrywki należy pozostawić w butelce z 6 M kwasem solnym na całą noc. Wczesnym rankiem następnego dnia należy przygotować Matrigel do powolnego rozmrażania na lodzie. Po czterech godzinach będzie on gotowy do użycia w celu zbudowania komory.

Najpierw, używając szklanego przecinaka z diamentową końcówką, wytnij z nowego kwadratu sześć prostokątnych pasków szkła. Numer jeden, szkiełka podstawowe. Przenieś przemyte kwasem kwadratowe i prostokątne szkiełka do komory z laminarnym przepływem powietrza.

Przemyj szklane paski 70% etanolem, a następnie wodą do hodowli tkankowych z autoklawu. Pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu lub osusz na papierze beztkaninowym. Następnie nanieś smar próżniowy na obrys jednej powierzchni każdego kwadratowego szkiełka przedmiotowego i przytwierdź je do podstawy z plastiku o średnicy 60 milimetrów.

Szalki Petriego. Nałożyć smar próżniowy na jedną stronę prostokątnych pasków szklanych i przykleić je do przeciwległych krawędzi kwadratu. Przedmioty szkiełka do tworzenia kwadratów z centralnym rynienką w środku każdej szalki.

Poddaj te zmodyfikowane szklane kwadraty lub komory sterylizacji UV przez co najmniej 15 minut w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie pipetuj od 250 do 300 µL poliolizyny na centralną rynnę komór. Następnie inkubuj komory w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, kończąc proces na około 15 minut przed planowanym rozpoczęciem kolejnego etapu.

Przygotować roztwór Matrigel po dwóch godzinach, odessać polilizynę i wypłukać centralne rynienki jednym mililitrem wody autoklawowanej. Następnie nanieść pipetą od 250 do 300 µL roztworu Matrigel do centralnych rynienek i inkubować komory w temperaturze 37 °C przez godzinę. Po inkubacji odessać roztwór Matrigel.

Następnie delikatnie przemyj centralne rynienki od jednym do dwóch mililitrów SFM. Teraz nanieś pipetą 100 µL E-F-H-S-F-M lub F-B-S-S-F-M do centralnych rynienek w celu przygotowania ich do hodowli komórek. Następnie przenieś pipetą od czterech do pięciu mililitrów hodowli zawierającej neurosfery do nowej szalki Petriego o średnicy 60 mm.

Następnie umieść szalkę Petriego na stoliku mikroskopu liczącego pod obiektywem powiększającym 5x. Za pomocą pipety P 10 delikatnie przenieś od pięciu do ośmiu całych neurosfer do centralnej rynny każdej komory. Do czterech.

Neurosfery można przenieść jednocześnie, jednak nie należy ich mieszać z neurosferami znajdującymi się w centralnych rowkach. Należy je ostrożnie rozłożyć, nie uszkadzając podłoża z matrigelu. Następnie do centralnych rowków należy dodać dodatkowe 150 µL pożywki E-F-H-S-F-M lub F-B-S-S-F-M.

Następnie hoduj komórki w inkubatorze z nawilżaczem. Po 17 do 20 godzinach hodowli dostępne będą niezróżnicowane NPC. Po 69 do 72 godzinach hodowli dostępne będą zróżnicowane NPC.

Pod mikroskopem liczącym należy wybrać komorę z komórkami najlepiej nadającymi się do analizy migracji w obrazowaniu żywych komórek. Komórki powinny być okrągłe, niemal całkowicie oddzielone od swoich neurosfer i nie powinny jeszcze tworzyć wypustek lub dopiero zaczynać je formować w dygestorze. Należy przygotować przykrywkę komory.

Umyj kwadratową szkiełkiem nakrywką 70% etanolem, a następnie wodą autoklawowaną i nałóż pasek smaru próżniowego na dwie równoległe krawędzie. Teraz przykryj komorę. Najpierw odessij pożywkę hodowlaną z centralnej rynienki, a następnie szybko zamocuj szkiełko nakrywkę na prostokątnych ściankach w sposób przypominający dach.

Następnie, wykorzystując zjawisko kapilarne, nanieś 100 µL świeżej pożywki do centralnej rynienki. Teraz użyj smaru próżniowego do stworzenia krawędzi dla zbiorników z pożywką hodowlaną. Na obu końcach centralnej rynienki w systemie obrazowania żywych komórek przygotuj probówki z żelem agarozy, elektrody srebrowe i srebrowo-chlorkowe oraz dwie szalki Petriego o średnicy 60 mm.

Aby służyły jako rezerwuary pożywki hodowlanej, pozostaw komory w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla na 20 do 30 minut. W tym czasie przygotuj pokrywy dwóch pustych szalek Petriego oraz pokrywę szalki Petriego z komorami Galvan Axxis, wiercąc w nich otwory za pomocą narzędzia Dremel lub pipety do narzędzi; nanieś 1,5 do 2 ml pożywki po każdej stronie centralnego koryta i dodaj od 7 do 8 ml SFM do każdej pustej szalki Petriego. Umieść jedną szalkę Petriego po każdej stronie centralnego koryta komory, a następnie włóż jedną elektrodę do każdej szalki.

Zatocz pomost między komorą a szalkami Petriego, aby zapewnić ciągłość elektryczną. Za pomocą mostków żelowych Agros podłącz elektrody do zewnętrznego zasilacza z szeregowo wpiertym miernikiem M w celu pomiaru natężenia prądu elektrycznego, a następnie włącz zasilacz. Użyj woltomierza do pomiaru natężenia pola elektrycznego bezpośrednio w obrębie centralnego koryta.

Dostosuj wyjście zasilacza zgodnie z potrzebami. Następnie uruchom moduł time-lapse w systemie obrazowania. W oprogramowaniu Axio vision wybierz wielowymiarową akwizycję (multidimensional acquisition) i kliknij see.

W sekcji kanałów wybierz kanał szósty, a następnie kliknij T, aby przejść do trybu time-lapse. W ustawieniach interwału time-lapse ustaw wartość jednej minuty, a czas trwania na osiem godzin w polach ustawień przed i po punkcie czasowym, wybierając odpowiednio punkt czasowy „przed” i „po”. Teraz kliknij start i pozwól eksperymentowi przebiegać przez żądany czas; po zakończeniu analizy przejdź do analizy IHC.

Analiza kinetyczna wykazała, że w obecności DCEF o natężeniu 250 mV/mm niedróżnicowane NPC wykazują silnie ukierunkowaną i szybką galwanotaksję w kierunku katody; przy tej wartości pola ponad 98% niedróżnicowanych NPC migrowało przez cały czas obrazowania, wynoszący od sześciu do ośmiu godzin. W przypadku braku DCEF obserwowano ruchy losowe komórek.

Ponieważ martwe komórki nie migrują, sugeruje to, że pozostają one żywotne w tym okresie. Wobec braku lub obecności A-D-C-E-F, fenotypy zróżnicowane wykazały pomijalną migrację, zarówno w obecności, jak i w nieobecności podzbiorów zróżnicowanych komórek A-D-C-E-F. Zaobserwowano wydłużone wypustki, które miały tendencję do ustawiania się prostopadle do kierunku DCEF, lecz nie odnotowano zauważalnej translokacji ciał komórkowych.

Immunobarwienie potwierdziło, że NPC zachowały pozytywną ekspresję markera prekursorów neuronalnych nestin po sześciu godzinach ekspozycji na DC EF. W testach obejmujących NPC indukowane do różnicowania w fenotypy dojrzałe, większość komórek wykazuje ekspresję markera dojrzałych astrocytów, którym jest glia lityczne kwaśne białko włókieniste lub GFAP, po sześciu godzinach ekspozycji na DCEF. Po przeprowadzeniu tej procedury można uzyskać wiedzę na temat mechanizmów komórkowych zaangażowanych w transdukcję prądu stałego w ruchliwość komórek, wykorzystując modele z knockoutem genetycznym.

Lub pan, na przykład.