Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

Ogólnym celem tej procedury jest przeszczepienie fragmentu grzbietowej rurki neuralnej z zarodka przepiórki do zarodka kurczaka o odpowiadającym mu stadium rozwoju, aby prześledzić migrację i los komórek grzebienia neuralnego. Realizuje się to poprzez wykonanie najpierw niewielkiego otworu w błonie IGN zarodka kurczaka-gospodarza, aby uzyskać dostęp do rurki neuralnej. Następnie zarodek przepiórki-dawcy zostaje wyjęty z jaja w celu przygotowania do wycięcia przeszczepu.

W następnym kroku obszar zainteresowania zostaje wycięty z rurki neuralnej embrionu biorcy. Następnie z rurki neuralnej dawcy wycina się podobny obszar w celu przeszczepienia. W kolejnym etapie rurka neuralna dawcy jest transplantowana do rurki neuralnej biorcy.

Na koniec chimeryczny embrion inkubuje się do pożądanego stadium w celu wykrycia komórek grzebienia neuronalnego, które dotarły do wybranego narządu. Ostatecznie migrację i różnicowanie pochodzących od donora komórek grzebienia neuronalnego w różnych lokalizacjach embrionu biorcy można zwizualizować za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy mikrodyssekcji i przeszczepiania wymagają bardzo precyzyjnych umiejętności motorycznych, co utrudnia ich opanowanie.

Rozpocznij od opłukania zanieczyszczeń z jaj kurzych letnią wodą. Ułóż jaja poziomo na tacy, a następnie zaznacz ołówkiem strony skierowane do góry, aby wskazać obszar, w którym znajdzie się zarodek. W przypadku przygotowania embrionów donora metodą X ovo, inkubuj nogi przepiórki stroną tępą do dołu.

W następnym kroku umieść jaja w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C i włącz funkcję kołysania. Po zakończeniu inkubacji jaj sterylizuj ich górne części, rozpylając 70% etanol, a następnie szybko wycierając je chusteczką Kimwipe. Aby zapobiec wchłanianiu cieczy przez skorupkę jaja, umieść każde wysterylizowane jajo na oddzielnym uchwycie, podobnym do szalki Petriego wyłożonej złożonymi chusteczkami Kimwipe, widocznych tutaj. Następnie, używając sterylnej pęsety AA, wykonaj niewielki otwór w górnej części skorupki jaja, na jego ostrym końcu.

Wyposażyć strzykawkę o pojemności 5 ml igłą hipodermiczną o rozmiarze 18,5 G. Następnie, kierując ścięcie igły w stronę szpiczastego końca jaja, wprowadzić igłę pionowo do otworu w skorupce. Aby uniknąć przypadkowego uszkodzenia żółtka poprzez zasysanie, oczyścić otwór 70% etanolem, tak jak wcześniej, a następnie zabezpieczyć otwór taśmą klejącą.

Następnie za pomocą pęsety typu double A należy wykonać kolejny otwór w zaznaczonej górnej powierzchni poziomego odnoga, nieco poniżej wierzchołka. Następnie włożyć jeden koniec zakrzywionej pęsety irydowej do otworu równolegle do jaja. Następnie należy ściskać skorupkę, wykonując ruchy okrężne.

Wykonaj otwór o średnicy dwóch centymetrów w skorupce jaja kurzego, a usunięty fragment skorupki wyrzuć. Zarodek powinien wyglądać jak nieprzezroczysty krążek na górnej powierzchni żółtka. Odrzuć wszystkie niezapłodnione jaja, które można zidentyfikować po małej białej plamce na powierzchni żółtka lub braku blastodermy.

Mając na sobie odpowiednią ochronę oczu, zgnij igłę hipodermiczną o rozmiarze 26,5 pod kątem 45 stopni, zaczynając od nasady igły. Po przymocowaniu zgiętej igły ściętą stroną do góry do strzykawki o pojemności 1 ml, napełnij ją rozcieńczonym tuszem indyjskim. Przebij błonę żółtka poza obrysem blastodermy i wsuń końcówkę igły pod embrion, blisko powierzchni żółtka, ale nie w warstwy embrionalne.

Następnie wstrzyknij taką ilość tuszu, aby jedynie obrysować zarodek, unikając wstrzyknięcia pęcherzyków powietrza. Ostrożnie wyjmij igłę. Teraz użyj stereomikroskopu oraz źródła światła o niskiej emisji ciepła, takiego jak pokazana tutaj lampa światłowodowa na elastycznym ramieniu.

Określ stadium rozwoju embrionów zgodnie z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona. Zapisz stadium na skorupkach jaj. Następnie nanieś dwie do trzech kropli ciepłego, sterylnego roztworu Ringera na powierzchnię embrionów, aby zapobiec ich odwodnieniu i kontaminacji.

Następnie naciągnij parafilm na powierzchnię jaj, aby tymczasowo uszczelnić okna. W kolejnym kroku przygotuj jaja przepiórcze do transplantacji. Przed wyjęciem jaj z inkubatora napełnij szalkę Petriego roztworem Ringera.

Następnie otwórz jaja od strony tępej za pomocą zakrzywionych pęset, aby odsłonić zarodek. Używając nożyczek sekcyjnych, wykonaj cztery cięcia w kształcie kwadratu przez błonę kosmkową i blastoderm poza obrębiem zarodka, upewniając się, że wszystkie cięcia łączą się ze sobą. Następnie, używając zakrzywionej pęsety irydowej, delikatnie chwyć jedną z krawędzi cięcia, wyjmij zarodek z jaja i przenieś go do przygotowanej szalki Petriego.

Na koniec ostrożnie usuń błonę witelinową za pomocą pęsety nr 5, a następnie określ stadium rozwoju embrionów pod mikroskopem stereologicznym. Usuń parafilm z embrionu kurczaka gospodarza. Następnie, używając zaostrzonej igły wolframowej, wykonaj mały otwór w błonie witelinowej w pożądanym obszarze rurki nerwowej.

Dodaj kroplę roztworu Ringera do zarodka. Następnie, w przypadku przeszczepów jednostronnych, takich jak ten wykonywany w tym filmie, użyj wyciągniętej szklanej igły, aby ostrożnie wykonać poprzeczne nacięcia rostralne i kaudalne w obrębie śródmózgowia rurki neuralnej, nie przekraczając światła rurki. Następnie wykonaj cięcia obustronne pomiędzy grzbietową częścią rurki neuralnej a mezodermą kątową.

Na koniec ostrożnie oddziel wycięty eksplant X od rurki nerwowej, a następnie usuń go z embrionu, odsysając go do szklanej mikropipety. Najpierw użyj embrionu przepiórczego o odpowiadającym stadium rozwoju. Następnie wycięnij obszar rurki nerwowej o podobnej wielkości, jak pokazano przed chwilą, i odessij eksplant X od dawcy do szklanej mikropipety zawierającej roztwór Ringera.

Przenieś eksplant X w bezpośrednie sąsiedztwo wyciętego obszaru gospodarza (zarodka pisklęcia). Następnie, używając wyciągniętej szklanej igły, zorientuj eksplant, delikatnie wprowadzając go w obszar ablacji. Ostrożnie dodaj do zarodka kilka kropli roztworu Ringera, aby zapobiec odwodnieniu.

Na koniec zaklej okno taśmą pakową, upewniając się, że taśma uszczelnia cały obszar okna w jajku, a następnie umieść jajko z powrotem w inkubatorze aż do osiągnięcia pożądanego stadium; podczas inkubacji wyłącz funkcję kołysania, przy czym jajka można delikatnie obracać ręcznie dwa razy dziennie, aby zwiększyć ich żywotność. Jeśli celem są późniejsze stadia rozwoju, ten reprezentatywny obraz regionu szczepionego rurki neurulowej po sześciu godzinach ponownej inkubacji do stadium HH 11 pokazuje oczekiwaną inkorporację szczepionej tkanki dawcy z przepiórnika do rurki neurulowej kurczaka biorcy. Ten przekrój poprzeczny przez region szczepiony w stadium HH 11 pokazuje komórki grzebienia neuronalnego znakowane hnk, z których jedna migruje bocznie, oddalając się od rurki neurulowej.

Komórki przepiórki uczestniczące w strumieniu migracyjnym komórek grzebienia neuronalnego oraz w cewiet przeznaczonej na układ nerwowy są wyraźnie znakowane za pomocą QCPN. Na późniejszych etapach komórki pochodzące z komórek grzebienia neuronalnego przepiórki mogą być śledzone aż do ich docelowych tkanek. Jak widać na tej rycinie, komórki znakowane QCPN są rozproszone w obrębie procesu szczękowego zarodka kurczaka. W stadium E5 przeciwciało QCPN można łatwo łączyć z innymi przeciwciałami w celu zbadania różnicowania komórek grzebienia neuronalnego pochodzenia przepiórki.

W środowisku gospodarza. Jak widać tutaj, neurony czuciowe nerwu trójdzielnego pochodzące z komórek grzebienia neuronalnego przepiórki są znakowane przeciwciałami QCPN oraz T UJ one. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia i hybrydyzacja in situ, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. jakie tkanki powstają z komórek grzebienia neuronalnego oraz jakie geny wykazują te komórki podczas różnicowania się w różne tkanki.