Sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek bez użycia energii elektrycznej

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie kwasów nukleinowych gotowych do PCR oraz białka immunoreaktywnego z próbki, bez konieczności korzystania z energii elektrycznej lub infrastruktury laboratoryjnej. Izolacja kwasów nukleinowych i białek rozpoczyna się od zmieszania próbki z guanidyną i tiocyjanianem w celu lizy próbki, a następnie przeprowadzenia mieszaniny przez sorbent znajdujący się w pipecie ekstrakcyjnej. Po piątym i ostatnim przejściu przez sorbent, mieszaninę przenosi się do buforu do ekstrakcji białek i odstawia w celu wyizolowania białka immunoreaktywnego.

Następnie sorbent oraz związane kwasy nukleinowe są płukane poprzez przepuszczanie 95% etanolu przez sorbent. Wielokrotnie osuszane są następnie sorbent i związane kwasy nukleinowe poprzez przepuszczanie powietrza otoczenia przez sorbent przez pięć minut. Ostatnim etapem izolacji kwasów nukleinowych gotowych do PCR jest elucja kwasów nukleinowych z sorbentu przy użyciu 250 µl buforu Tris lub innego podobnego roztworu wodnego w celu izolacji białka immunoreaktywnego.

Po zmieszaniu próbki z buforem do ekstrakcji białek, należy użyć drugiej pipety do ekstrakcji i przepuścić mieszaninę przez sorbent 15 razy. Kolejnym krokiem jest przemycie sorbentu z związanym białkiem poprzez wielokrotne przepuszczenie 95% ethanol przez sorbent. Następnie sorbent i związane białko są suszone poprzez przepuszczanie powietrza otoczenia przez sorbent przez pięć minut.

Ostatnim krokiem protokołu jest elucja białka z sorbentu. W rezultacie pipeta ekstrakcyjna wykorzystana w tej procedurze umożliwia izolację kwasów nukleinowych gotowych do PCR oraz białek immunoreaktywnych bez użycia energii elektrycznej. Cześć, nazywam się Dave Pawlowski.

Jestem starszym naukowcem badawczym w firmie Kubrick Incorporated w Buffalo w stanie Nowy Jork. Dzisiaj zapoznamy się z techniką, która pozwala na jednoczesną izolację białek i kwasów nukleinowych bez konieczności użycia wirówki, wibratora typu vortex ani żadnego innego dodatkowego sprzętu laboratoryjnego przed lizą próbek. Należy upewnić się, że próbki są w formie ciekłej. Jeśli próbka jest stała, na przykład żywność lub kał, powinna zostać zawieszona w medium ciekłym, takim jak woda lub roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym.

Wymieszaj 500 µL próbki z 500 µL sześciomolarnego tiycyjanianu guanydyny w probówce o pojemności 1,5 mL. Następnie naciśnij gruszkę pipety ekstrakcyjnej, aby usunąć z niej powietrze. Powoli puść gruszkę, pozwalając jej się rozszerzyć, i wciągnij całą próbkę o objętości 1 mL do pipety ekstrakcyjnej przez materiał absorbujący.

Odwróć narzędzie do ekstrakcji w taki sposób, aby kulek sorbentu i próbka spłynęły do kolby. Rozetrzyj kulki sorbentu wraz z próbką w kolbie, uważając, aby nie wypchnąć próbki z pipety ekstrakcyjnej.

Odwróć pipetę ekstrakcyjną i wydmuchaj próbkę do oryginalnej probówki o pojemności 1,5 ml. Pobierz całą 1 ml próbki do pipety ekstrakcyjnej, przepuszczając ją przez sorbent z umiarkowaną prędkością. Uważając, aby sorbent pozostał w szyjce pipety ekstrakcyjnej, wydmuchaj całą próbkę do probówki 1,5 ml, naciskając gruszkę.

Powtórz ten proces, przepuszczając próbkę przez sorbent jeszcze cztery razy, tak aby łącznie wykonać pięć przejść. Po piątym przejściu przez sorbent, przetłocz całą próbkę o objętości 1 ml do 4 ml buforu do ekstrakcji białek w probówce stożkowej o pojemności 15 ml. Wymieszaj zawartość probówki przez odwracanie, a następnie zamknij ją i odstaw do późniejszego użycia.

Przemyj wyizolowane kwasy nukleinowe, przepuszczając jeden mililitr 95% ethanolu przez sorbent trzy razy, przelewając etanol z powrotem do pierwotnej probówki. Po ostatnim przelewie powtórz płukanie trzykrotnie, używając drugiego mililitra 95% ethanolu. Kolejnym krokiem procedury jest osuszenie sorbentu; odzysk kwasów nukleinowych z sorbentu jest najskuteczniejszy, gdy sorbent jest suchy.

Wiem, że ten etap jest żmudny. Jednakże, jeśli wykonają Państwo ten krok w zalecanym czasie, uzyskane wyniki będą lepsze. Naciskaj i puszczaj gruszkę przez pięć minut.

Przesuwając powietrze przez pipetę ekstrakcyjną w celu osuszenia kwasów nukleinowych i złoża sorbentu, przetrzyj końcówkę pipety ekstrakcyjnej, aby usunąć pozostałości etanolu. Używając chusteczki Kim wipe, odzyskaj kwasy nukleinowe, przepuszczając 250 µL 10 mM Tris przez sorbent pięć razy. Bufor Tris można zastąpić innym odpowiednim roztworem wodnym, np. PBS.

Otrzymany roztwór zawiera wyekstrahowane kwasy nukleinowe. Aby najpierw przeprowadzić ekstrakcję białek, wymieszaj próbkę w buforze do ekstrakcji białek, który został wcześniej odstawiony, odwracając probówkę. Przenieś około dwa do trzech mililitrów tej pięciomililitrowej próbki na sorbent nowej pipety ekstrakcyjnej. Wypchnij całą próbkę do tej samej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów, uważając, aby sorbent pozostał w szyjce pipety ekstrakcyjnej.

Powtórz ten proces, przepuszczając próbkę przez sorbent 15 razy. Przemyj sorbent i związane białko, przepuszczając jeden mililitr 95% etanolu przez złoże sorbentu trzy razy, odprowadzając etanol do pierwotnej probówki; przemyj go trzykrotnie, używając kolejnego jednego mililitra 95% etanolu do płukania.

Kolejnym krokiem procedury jest ponowne wysuszenie sorbentu. Podobnie jak w przypadku kwasów nukleinowych, odzysk białek przebiega najlepiej, gdy sorbent jest wysuszony. Przez dłuższy czas.

Naciskaj i zwalniaj gruszkę przez pięć minut, przepuszczając powietrze przez pipetę ekstrakcyjną. Aby osuszyć złoże sorbentu białkowego, wytrzyj pozostały etanol z końcówki pipety ekstrakcyjnej. Używając chusteczki Kim wipe, odzyskaj białko, przepuszczając przez sorbent 250 µL PBS pięciokrotnie.

Bufor PBS można zastąpić dowolnym innym odpowiednim roztworem wodnym, takim jak 10 milimolowy Tris o pH 6,8. Powstały roztwór zawiera zawartość białek z próbki. Geny toksyny Shiga powiązane ze szczepem E DL 9 33 enterohemolitycznej E. coli O157:H7 zostały namnożone w procedurze ekstrakcji białek z kwasów nukleinowych przy użyciu pipety do ekstrakcji.

Geny toksyny Shiga, toksyny Shiga 1 i toksyny Shiga 2, znajdują się na umiarkowanych fagach bakteryjnych podobnych do lambda oraz na wadliwych fagach bakteryjnych pod kontrolą promotora PR. Aktywacja odpowiedzi SOS w e coli prowadzi do indukcji profagów i/lub produkcji toksyny. W tym przypadku obserwuje się znaczny wzrost amplifikacji genu toksyny Shiga 2, gdy odpowiedź SOS zostanie wywołana przez mitomycynę C, w porównaniu z kontrolą nieleczoną.

Sugeruje to indukcję profagów i replikację genomu fagowego. Białko odzyskane w ramach eksperymentów izolacji białek z kwasów nukleinowych opisanych w filmie wykazuje reaktywność immunologiczną. Izolowana frakcja białkowa została naniesiona na paski testowe do szybkiego wykrywania E. coli O 157 w teście przepływu bocznego.

Kontrole wykazują pozytywną identyfikację we wszystkich próbkach zawierających e coli oh 1 5 7 z indukcją lub bez indukcji shiga toin, co jest widoczne w postaci dwóch czerwonych prążków. Dane wykazują również wyniki pozytywne dla tych próbek zawierających e coli oh 1 5 7, w których kwasy nukleinowe i białka opracowano przy użyciu pipety ekstrakcyjnej. Dane te pokazują, że wyizolowane białko z każdej próbki jest immunoaktywne, wywołując tym samym reakcję pozytywną.

Wyizolowane białko nadaje się do elektroforezy, co przedstawiono tutaj na żelu 8% akrylamidu barwionym kumasym, na który naniesiono BSA wyizolowane z sześciomolarnego izotiocyjanianu gudiny. Przy zastosowaniu opisanej metody ekstrakcji, pipetowania i powiązanego protokołu, mobilność elektroforetyczna wyizolowanego białka jest identyczna jak w przypadku próbek kontrolnych. Po opanowaniu techniki można ją przeprowadzić w czasie krótszym niż 20 minut.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak izolować białka i kwasy nukleinowe z tego prostego urządzenia. Dziękujemy za poświęcenie czasu na obejrzenie naszego filmu.