Analiza i budowanie struktur kwasów nukleinowych przy użyciu programu 3DNA

Ogólnym celem niniejszej procedury jest udostępnienie pakietu programów 3D NA naukowcom laboratoryjnym oraz innym badaczom w celu analizy organizacji przestrzennej DNA i RNA przy użyciu nowoczesnych narzędzi obliczeniowych. Jest to realizowane poprzez pobranie oprogramowania z forum 3D NA i jego instalację na lokalnym komputerze. Drugim krokiem jest analiza reprezentatywnej struktury DNA na poziomie poszczególnych kroków par zasad.

Następnie ta sama struktura DNA zostaje zmodyfikowana na poziomie parametrów kroków par zasad, a potem przebudowana z wykorzystaniem nowo zdefiniowanych parametrów. Kolejnym krokiem jest analiza dużego zespołu powiązanych struktur. Ostatnim etapem jest dopasowanie zestawu powiązanych struktur DNA do wspólnego układu odniesienia w celu wizualizacji globalnych zniekształceń struktur.

W ostateczności narzędzia 3D NA służą do badania, w jaki sposób poszczególne kroki par zasad, w tym te związane z lekami i białkami, wpływają na ogólne zwijanie się DNA oraz do identyfikacji miejsc i kierunków znacznych zniekształceń globalnych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że oprogramowanie jest odporne i szeroko stosowalne do różnorodnych struktur zawierających kwasy nukleinowe. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biochemii i biofizyki, takie jak sposób organizacji genomów w trzech wymiarach oraz rodzaje deformacji, jakie może przyjąć DNA.

Aby rozpocząć instalację pakietu oprogramowania, połącz się ze stroną internetową three DA pod adresem @xthreed. org i kliknij link do forum 3D NA. W obrębie forum wybierz link do rejestracji i postępuj zgodnie z instrukcjami w celu utworzenia nowego konta.

Po utworzeniu nazwy użytkownika i hasła zaloguj się na forum, wybierz łącze do pobierania w sekcji powitalnej, a na nowej stronie wybierz pobieranie 3D NA. Kliknij dwukrotnie plik tar gz, aby utworzyć folder o nazwie X 3D NA dash V 2.1, który zawiera oprogramowanie 3D NA. Otwórz aplikację terminala, zazwyczaj znajdującą się w narzędziach w systemie Macintosh, i przejdź do katalogu X 3D NA dash V 2.1.

Uruchom skrypt konfiguracyjny niezbędny do prawidłowego funkcjonowania 3D NA. Wszystkie polecenia wykorzystane w tym filmie znajdują się w protokole tekstowym. Następnie skopiuj dwuliniowe ustawienia eksportu, które wyświetlają się na ekranie.

Jeśli użytkownik umieścił oprogramowanie w katalogu aplikacji, dwie linie powinny pojawić się tak, jak pokazano tutaj. Otwórz aplikację do edycji tekstu znajdującą się w katalogu aplikacji. W menu formatu wybierz opcję Utwórz zwykły tekst.

Jeśli istnieje plik .bashrc, otwórz go w edytorze tekstu, a następnie wklej ustawienia eksportu na końcu pliku. Jeśli plik .bashrc nie istnieje, wklej ustawienia eksportu do pustego pliku i zapisz go pod nazwą .bashrc w katalogu domowym. Aby nowe ustawienia były dostępne, uruchom nowo zapisany plik .bashrc w programie terminala.

Niniejszy film demonstruje analizę reprezentatywnej struktury kwasu nukleinowego, mianowicie DNA związanego z białkiem HBB z bakterii Borrelia bergdorfii. Pierwszym krokiem w analizie 3D kwasów nukleinowych jest utworzenie pliku zawierającego listę wszystkich sparowanych zasad. Odbywa się to poprzez wpisanie polecenia uruchamiającego program Find pair dla struktury atomowej zapisanej w pliku NP two, MP two pdb.

Kolejnym krokiem analizy jest wyznaczenie parametrów geometrycznych charakteryzujących strukturę. Polecenie analyze przyjmuje jako dane wejściowe plik par zasad i tworzy kilka plików wyjściowych, które pojawiają się w katalogu roboczym. Wartości geometryczne można następnie obliczyć, wpisując analyze two MP two bps.

Wygenerowane pliki wyjściowe obejmują plik mp2out, który zawiera przegląd obliczonych parametrów, oraz bpco_steppar, zawierający listę parametrów ciał sztywnych. Oprócz analizy struktury kwasów nukleinowych, oprogramowanie 3D NA umożliwia budowę modelu strukturalnego na podstawie parametrów ciał sztywnych za pomocą polecenia rebuild, aby stworzyć przybliżony model atomowy, który zawiera współrzędne zarówno dla atomów szkieletu, jak i zasad. Wpisz polecenie wymienione w tekście. Polecenie to instruuje program 3D NA do wprowadzenia standardowej konformacji szkieletu B-DNA podczas konstruowania modeli z parametrów ciał sztywnych.

Model podwójnej helisy z parametrami ciała sztywnego znalezionymi w strukturze H-B-B-D-N-A można następnie zbudować, wpisując odpowiednią komendę. Plik par kroku bpco można edytować w celu wygenerowania zmodyfikowanej struktury. W tym przypadku zmodyfikowano ekstremalne kąty roll powstałe w dwóch miejscach największego zgięcia.

Następnie budowana jest struktura, wykorzystując zmodyfikowany zestaw parametrów kroków jako plik wejściowy. Oba modele można wyświetlić w standardowym programie do wizualizacji cząsteczkowej, w przeciwieństwie do analizy pojedynczej struktury zawierającej kwas nuklenowy. Ta część filmu pokaże, jak analizować duży zespół struktur w zestawie plików, zaczynając od nazw MD_set1.pdb i kończąc na numerze.

Pierwszym krokiem w analizie jest identyfikacja sparowanych zasad poprzez uruchomienie programu find pair zgodnie z wcześniejszą procedurą; ponieważ cały zestaw struktur posiada ten sam schemat parowania zasad, należy uruchomić find pair tylko raz na reprezentatywnym pliku, w tym przypadku pliku kończącym się na 1001. Generuje to informacje o parowaniu zasad i zapisuje je w pliku MD at set one BPS PS. Kolejnym krokiem jest wyznaczenie parametrów geometrycznych dla całego zestawu struktur za pomocą polecenia X 3D ncore ensemble.Analyze. Następnie żądane parametry ciała sztywnego można wyodrębnić z pliku wyjściowego z przeglądem MD at set one out.

Procedurę tę wykonuje się przy użyciu funkcji Command X three DCO ensemble extract. Wyodrębniane są kąty roll, a następnie tworzony jest plik tekstowy z kątami roll rozdzielonymi przecinkami. Plik ten może zostać wczytany do innych programów w celu przeprowadzenia dalszej analizy i wygenerowania wykresów.

Najnowsza wersja 3D NA posiada nową funkcję, która umożliwia użytkownikowi analizę wielu struktur z wspólnej perspektywy. Polecenie X three DCO ensemble reorient superponuje zbiór powiązanych struktur na wspólnej parze zasad lub stopniu parowania zasad, analogicznie do wcześniejszych protokołów. Pierwszym krokiem jest obliczenie parowania zasad DNA za pomocą programu find pair.

W tym przypadku plikiem wejściowym jest plik PDB z KEK zawierający 10 struktur operatora O 3D NA z C. coli związanego z częścią głową białka represora LAC. Komenda X three DCO ensemble reorient wyrówna poszczególne modele w strukturze wielomodelowej względem wspólnej ramy odniesienia. Komenda ta wymaga jako dane wejściowe zarówno pliku PDB, jak i pliku par zasad z poprzedniego kroku.

W poleceniu zawarto również tożsamość stopnia pary zasad, względem którego wyrównane są wszystkie struktury. Interfejs internetowy W 3D NA zawiera niektóre popularne funkcje pakietu oprogramowania 3D NA. Ta część filmu zwraca uwagę na możliwość konstruowania za pomocą serwera internetowego trójwymiarowych modeli DNA z przyłączonymi białkami.

Pierwszym krokiem w budowaniu modelu DNA udekorowanego białkiem jest odwiedzenie strony internetowej W 3D NA dostępnej pod adresem W three d.rutgers.edu. Wybranie opcji Reconstruction z menu w lewym górnym rogu strony aktywuje funkcje budowania modeli online. Następnie należy kliknąć łącze bound protein DNA template znajdujące się w jasno zaznaczonym polu na środku nowej strony.

Ten wybór aktywuje menu rozwijane, które pozwala użytkownikowi określić liczbę związanych białek. Wybór liczby związanych białek prowadzi do nowej strony specyfikacji. Użytkownik może następnie wpisać lub wkleić żądaną sekwencję.

W polu tekstowym, na środku nowej strony, znajduje się rozwijane menu poniżej pola tekstowego, służące do wyboru konformacji helikalnej nie związanych obszarów DNA. W dolnej części strony specyfikacji znajduje się pole tekstowe do wpisania pozycji wiązania i nazw plików związanych białek. Pozycja wiązania określa położenie środka fragmentu białka związanego z sekwencją DNA.

Na dole strony specyfikacji znajduje się pole umożliwiające użytkownikowi wygenerowanie podglądu DNA związanego z białkiem. W tym przypadku pole to zostaje zaznaczone, a następnie kliknięto przycisk kontynuuj. Czynność ta generuje stronę przeglądu zawierającą listę wybranych parametrów, a także wszelkie błędy, które mogły wystąpić w wyniku nakładania się wybranych miejsc wiązania.

Użytkownik może wybrać przycisk powrotu, jeśli wymagane są jakiekolwiek zmiany, lub przycisk buduj, aby kontynuować. Następna strona wyświetla statyczny obraz kompleksu białko-DNA w jego najbardziej rozciągniętej konfiguracji oraz umożliwia interaktywną wizualizację online przez sieć WWW. Użytkownik może również pobrać plik zawierający współrzędne atomowe.

Narzędzia programistyczne 3D NA są rutynowo wykorzystywane do analizy struktur kwasów nukleinowych. Wartości parametrów bryły sztywnej ujawniają zniekształcenia w strukturze trójwymiarowej, takie jak dwa miejsca ekstremalnego wygięcia DNA w kierunku bruzdy większej z dużymi dodatnimi kątami roll, stwierdzone na stopniach 13 i 22. W kompleksie krystalicznym DNA z białkiem Borrelia Bergdorf, RHBB.

Zdolność oprogramowania do rekonstrukcji struktur na podstawie tych wartości umożliwia określenie, w jaki sposób poszczególne zasady oraz kroki par zasad wpływają na ogólne zwinięcie cząsteczki. Jak pokazano tutaj, globalne zgięcie DNA indukowane przez HBB odzwierciedla więcej niż dwa ekstremalne zniekształcenia ról wspomniane powyżej. DNA pozostaje silnie zakrzywione po zrekonstruowaniu z wyprostowanymi krokami tych par zasad.

Dzieje się tak, gdy dwie największe wartości roli zostają ustawione na zero. Nowa możliwość badania w 3D NA dużych liczb powiązanych struktur pozwala na wyodrębnienie wzorców zależnych zarówno od sekwencji, jak i czasu w rozmieszczeniu przestrzennym symulowanych cząsteczek DNA i RNA. Na przykład, żółta kolorystyka kątów obrotu między kolejnymi parami zasad w dwóch dużych zestawach symulowanych struktur DNA ujawnia preferencyjne zginanie tych cząsteczek na stopniach par zasad purynowych Permian.

Wyższe wartości rollu przedstawione na czerwono, które utrzymują się przez krótkie okresy na końcach DNA, sugerują lokalne topnienie i ponowne zwijanie się struktury podwójnej helisy. Zmienne wzorce innych parametrów ciała sztywnego, takich jak kąty i odległości między komplementarnymi zasadami, mogą pomóc w rozszyfrowaniu precyzyjnych zniekształceń strukturalnych. Zdolność oprogramowania 3D NA do reorientacji powiązanych cząsteczek w wspólnej ramie odniesienia ujawnia cechy ogólnej struktury ukryte w wielu plikach przechowywanych w banku danych białek.

Na przykład konwencjonalne dopasowanie powiązanych struktur na podstawie średniokwadratowego odchylenia (RMSD) odpowiadających atomów daje serię podobnych ścieżek przestrzennych, które w tym przypadku niemal całkowicie się pokrywają – są to 10 modeli opartych na NMR operatora O₃ E. coli związany z domenami głowowymi białka represora LAC; natomiast superpozycja tych samych struktur w jednej ramie współrzędnych względem pary zasad na końcu 5' każdego dupleksu ujawnia znaczne zniekształcenia struktury globalnej, w których cząsteczki wyginają się w wyraźnie różnych kierunkach. Zmienność strukturalna może wpływać na łatwość, z jaką białko represora LAC E. coli wiąże się z O₃ i indukuje pętlę między O₃ a sekwencyjnie oddalonymi operatorami w operonie LAC. Jak pokazano tutaj, precyzyjne rozmieszczenie białka architektonicznego, takiego jak HBB z Borrelia burgdorferi, może mieć drastyczny wpływ na ogólny sposób zwinięcia DNA.

Jeśli dwie kopie znanej struktury o wysokiej rozdzielczości są oddzielone od siebie 43 parami zasad, fragment DNA o długości 81 par zasad zamyka się w ciasnej, niemal kolistej konfiguracji. Jeśli dwa białka są oddzielone dodatkowymi pięcioma parami zasad, DNA przyjmuje otwartą, meandrującą formę. Te bardzo odmienne układy dupleksu z przyłączonymi białkami pokazują, w jaki sposób rozmieszczenie białek architektonicznych może wpływać na cyklizację lub zapętlenie DNA po jego sformowaniu.

Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii strukturalnej kwasów nukleinowych do badania oddziaływań białek z DNA, RNA, fałdowania oraz projektowania nanocząsteczek, aby lepiej zrozumieć wady rozwojowe i choroby, takie jak nowotwory, oraz opracować nowe metody terapeutyczne.