Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w celu poszukiwania małocząsteczkowych modulatorów potasowych kanałów prostujących do wewnątrz

Ogólnym celem niniejszej procedury jest odkrycie nowych związków modulujących aktywność potasowych kanałów prostujących do wnętrza komórki. Jest to realizowane poprzez najpierw wysianie na płytkę 384-dołkową komórek HEK 293 z indukowaną tetracykliną ekspresją interesującego kanału KIR. Drugim krokiem jest załadowanie komórek fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym talu o nazwie fluo-in-2.

Następnie nieprzywiązanym barwnikiem wypłukuje się komórki, a następnie zastępuje go buforem do analizy zawierającym kontrolę nośnika lub badane związki. Ostatnim krokiem jest dodanie do studniek buforu stymulującego w celu zainicjowania przepływu talu. Na koniec wykorzystuje się czytnik płytek fluorescencyjnych do zidentyfikowania związków, które zmieniają ruch jonów talu przez kanał KIR.Słaba.

Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak ręczna elektrofizjologia patch-clamp, jest to, że umożliwia ona badaczowi przeprowadzenie setek eksperymentów jednocześnie i tysięcy eksperymentów dziennie. Metoda ta pozwala badaczowi na przesiewanie bibliotek tysięcy małych cząsteczek w celu odkrycia modulatorów wewnątrzstymulowanych kanałów potasowych. Na dzień przed eksperymentem z przepływem talu należy zdysocjować komórki i wyznaczyć gęstość zawiesiny komórkowej zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Następnie, używając podłoża BH zawierającego 10% dializowanego FBS, należy wysiać 20 000 monoklonalnych komórek stabilnie transfektowanych genem interesującego kanału KIR do każdej studni płytki BD pure coat Amin coated z 384 studniami, wykorzystując Thermo MultiDrop Combi lub pipetę wielokanałową. Następnego dnia należy sprawdzić płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki przylegają i są równomiernie rozłożone na dnie studni.

Następnie użyj myjki do mikropłytek ELX 4 0 5, aby zastąpić pożywkę do hodowli komórek buforem HBSS w ilości 20 µL na dołek. Po tym kroku przygotuj roztwór ładujący flus w 2:00 AM D, krótko wirując probówkę, aby rozpuścić 50 µg proszku flus w 100 µL bezwodnego DMSO.

Następnie dodaj 50 µL 20% (m/v) roztworu onic F1 27 w DMSO do barwnika. Wymieszaj je, delikatnie pipetując. Następnie dodaj 150 µL flus in 2:00 AM onic F1 27 do 35 ml buforu assay HBSS i delikatnie wymieszaj.

Następnie do każdej studni zawierającej 20 µL buforu do testu HBSS należy dodać 20 µL buforu do ładowania barwnika. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez około jedną godzinę, aby umożliwić ich obarwienie. Przygotować płytkę ze stymulacją talem, rozpuszczając na świeżo 0,5 g wodorowęglanu sodu w 50 mL pięciokrotnego stężenia buforu do stymulacji talem.

Następnie dodaj 50 µL roztworu do każdej studzienki polipropylowej płytki 384-studzienkowej. Po załadowaniu komórek fluroforem przez 2:00 AM, przemyj płytkę za pomocą myjki do mikropłytek ELX 4 0 5. Następnie do każdej studzienki dodaj 20 µL lub 40 µL buforu do analizy HBSS; płytka jest teraz gotowa do przeprowadzenia doświadczeń.

Wprowadź płytki z talem oraz płytki z komórkami do systemu funkcjonalnego przesiewania leków Hema Matsu lub równoważnego czytnika płytek do obrazowania kinetycznego z zintegrowaną funkcją dozowania cieczy, stosując odpowiednie filtry dla barwników opartych na fluoresceinie, takich jak flu oh four. Następnie skonfiguruj protokół pojedynczego dodawania, aby dodać 10 µL serii 5X Thallium do odpowiednich dołków płytki z komórkami zawierających 40 µL buforu do analizy HBSS. Następnie zarejestruj fluorescencję bazową przy częstotliwości próbkowania 1 Hz przez co najmniej 10 sekund.

Po ustaleniu optymalnych warunków siania komórek, płukania i ładowania, fluorescencja między poszczególnymi studniami powinna być jednolita i stabilna w obrębie całej płytki. W tym czasie należy użyć zintegrowanego pipetora 384-kanałowego, aby jednocześnie dodać bufor stymulujący talem do każdej studni, i kontynuować rejestrację przez co najmniej dwie minuty, aby uchwycić tempo oraz szczyt wzrostu fluorescencji indukowanego talem do późniejszej analizy offline. W następnej serii doświadczeń należy ocenić jednolitość i powtarzalność testu, siejąc inhibitor kontrolny w co drugiej studni każdego rzędu i kolumny płytki 384-dołkowej oraz dodając DMSO do pozostałych studni jako kontrolę nośnika.

Użyj pipety wielokanałowej. Przygotuj płytkę z DMSO i związkiem, pipetując inhibitor docelowego kanału KIR w wcześniej określonym stężeniu w ilości 80 µL na studzienkę oraz nośnik 0,1% DMSO do polipropylenowej płytki 384-dołkowej. Procedurę tę wykonuje się poprzez dodawanie znanego inhibitora, zaczynając od studzienki A1 i naprzemiennie do studzienki B2 i tak dalej, aż do studzienki B24.

Powtórz tę procedurę z DMSO, zaczynając od dołka B1 i tak dalej, aż do dołka A24. Następnie umieść płytkę z komórkami, płytkę z związkami oraz płytkę ze stymulatorem talem w czytniku płytek. Następnie skonfiguruj protokół dodawania, aby dodać 20 µL serii związków o stężeniu 2X do odpowiednich dołków płytki z komórkami zawierającej 20 µL buforu do testów HBSS.

Dodaj związki do płytki z komórkami i inkubuj je przez maksymalnie 20 minut w temperaturze pokojowej. Zarejestruj bazową fluorescencję dla dwóch kanałów fluorescencyjnych przez co najmniej 10 sekund. Następnie dodaj 10 µL pięciokrotnego buforu talowego do każdej studzienki płytki z komórkami.

Powtórz eksperyment w ciągu trzech kolejnych dni, aby ustalić powtarzalność wyników. Wykorzystaj strumień talu w DMSO oraz komórki traktowane lekiem do obliczenia wartości Z prime. Jako statystyczną miarę zmienności między poszczególnymi studzienkami w dwóch populacjach studzienek oblicz Z prime, korzystając z następującego wzoru opartego na średnich i odchyleniach standardowych P oraz N, gdzie P to wartość strumienia nieinhibowanego, a N to wartość strumienia całkowicie inhibowanego.

Test z wartościami ZPrime większymi lub równymi 0,5 w trzy oddzielne dni jest uznawany za odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Te rysunki przedstawiają kilka przykładów map wysiewu komórek stosowanych w różnych rodzajach eksperymentów. Pozycje studzienek zawierających komórki nieindukowane lub indukowane tetracykliną są zaznaczone różnymi kolorami.

Rysunek ten przedstawia mapę płyty źródłowej użytej do wyznaczenia optymalnego stężenia talu dla opracowania testu i screeningu związków. Gradient kolorów reprezentuje trzykrotny szereg rozcieńczeń w zakresie od 100% do 0,002% talu, a tutaj przedstawiona jest reprezentatywna mapa intensywności fluorescencji z kolorami od zimnych do gorących, wskazująca niskie i wysokie wartości strumienia talu. Przedstawiona tutaj mapa wysiewu komórek z dopasowaniem czteroparametrowej funkcji logistycznej do krzywej odpowiedzi koncentracyjnej (CRC) talu służy do wyznaczenia wartości EEC 80 wynoszącej 15% talu.

Rysunek ten przedstawia mapę płytki źródłowej wykorzystanej do określenia tolerancji DMSO w teście. Kolumny 1 i 24 zawierają wyłącznie bufor testowy, natomiast gradient kolorów wskazuje dwukrotną serię rozcieńczeń w zakresie od 10% do 0,01% DMSO; przedstawiono tutaj reprezentatywną mapę intensywności fluorescencji, w której niskie wartości strumienia talu są oznaczone ciemniejszym odcieniem niebieskiego. Tutaj zestawiono średnie wartości strumienia talu zarejestrowane w studzienkach zawierających wskazane stężenia DMSO.

Na niniejszej ilustracji przedstawiono mapę płytki źródłowej wykorzystanej do wyznaczenia krzywych zależności odpowiedzi od stężenia dla znanych inhibitorów kanału KIR. Każdy związek jest oznaczony innym kolorem i zazwyczaj nanoszony na płytkę w formie serii rozcieńczeń trzykrotnych. Przedstawiono tutaj reprezentatywną mapę intensywności fluorescencji, a rycina ta ukazuje zależne od dawki hamowanie strumienia talu przez inhibitor po jego opracowaniu i optymalizacji.

Test przepływu talu może być również wykorzystywany do przeprowadzania różnych rutynowych analiz farmakologicznych. Metoda ta została wcześniej zaadoptowana do badań nad bramkowanymi napięciowo i ligandowo kanałami potasowymi, nieselektywnymi kanałami kationowymi, a nawet transporterami potasu. Należy pamiętać, że praca z talem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie rękawiczek i odpowiednia utylizacja odpadów.