Zastosowanie LysoTracker do wykrywania programowanej śmierci komórki w embrionach i różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych

Celem poniższej procedury jest zademonstrowanie sposobu barwienia lizosomów w dwóch rodzajach próbek: embrionów myszy oraz zróżnicowanych komórek macierzystych przy użyciu barwnika LysoTracker w celu wykrycia wzorców śmierci komórkowej. W celu przygotowania próbek embrionów, embriony są najpierw izolowane chirurgicznie i umieszczane w szalce w celu przygotowania zróżnicowanych komórek. Do stworzenia ciał embrionalnych wykorzystuje się embrionalne komórki macierzyste.

Zarodki te są hodowane w zawiesinie, a następnie namnażane jako monowarstwa na szkiełku komorowym. Zarodki w monowarstwie można inkubować z LysoTracker Red, a następnie przemyć i utrwalić próbki; tak przygotowane próbki można sfotografować w celu zbadania i ilościowego określenia wyników barwienia wykazujących obecność LysoTracker. Barwienie jest prostą procedurą, którą można wykorzystać do badania programowanej śmierci komórki w zarodkach i hodowlach komórkowych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza TUNEL, jest fakt, że dzięki zastosowaniu barwnika OT tracker, który jest małą cząsteczką, grube tkanki można badać szybko i łatwo. Choć metoda ta pozwala na wgląd w wzorce programowanej śmierci komórkowej w embrionach myszy i kulturach zróżnicowanych, może być ona również stosowana w innych typach tkanek, takich jak embriony kurczaków i różnicujące się dorosłe komórki macierzyste. Sparuj młode samice myszy z samcem rozpłodnicowym i każdego kolejnego ranka sprawdzaj obecność czopu pochwowego, który wskazuje na zajście zapłodnienia.

Południe w dniu pojawienia się czopu pochwowego uznaje się za 0,5 dnia. Po kopulacji, w interesującym badacza dniu embrionalnym, przeprowadzić eutanazję samicy zgodnie z zatwierdzonymi protokołami, a następnie przenieść macicę do 10-centymetrowej szalki Petriego z roztworem Hank's BSS i wypłukać krew. Wyseparować embriony i wyjąć je z macicy.

Usuń nadmiar błon zarodkowych i wykonaj przynajmniej jedno płukanie w roztworze Hank's BSS, aby usunąć zbędne tkanki i krew. Przechowuj wypreparowane zarodki na lodzie podczas oczyszczania. Pozostałe.

Przygotuj pięć mililitrów roztworu barwiącego zarodki Liso tracker. Jest to objętość wystarczająca dla jednej lub dwóch kolekcji zarodków. Delikatnie wymieszaj roztwór, aby równomiernie rozprowadzić barwnik, następnie przenieś zarodki do roztworu i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 45 minut.

Po inkubacji delikatnie przemyj embriony w roztworze Hank's BSS czterokrotnie, wykonując każde płukanie przez pięć minut. Ważne jest, aby płukać delikatnie, aby nie uszkodzić tkanki. Powoli usuń ciecz, uważnie obserwując położenie delikatnych embrionów i zawsze pozostawiając niewielką ilość płynu, która będzie je zakrywać.

Następnie utrwalaj zarodki w 4% paraformaldehydzie przez noc w dniu następnym. Przepłucz zarodki raz w roztworze Hank's BSS przez 10 minut, aby usunąć utrwalacz. Teraz odwodnij tkanki za pomocą serii metanolu, aby wyeliminować barwienie tła.

Ten etap poprawia stosunek sygnału do szumu podczas obrazowania przed przechowywaniem. Jeśli jest to konieczne, pobierz próbkę tkanki z każdego zarodka do analizy genetycznej. Następnie rehydratuj próbkę tkanki przed genotypowaniem.

Rozdziel zarodki do poszczególnych probówek z etykietami odpowiadającymi próbce tkanki. Obecnie możliwe jest nieograniczone przechowywanie wyizolowanych zarodków w metanolu w temperaturze -20 °C, w warunkach ochrony przed światłem.

Rozpocznij od przygotowania ciał embrionalnych metodą wiszącej kropli. Przy początkowej gęstości 500 komórek na 20 µL kropli, po trzech dniach przenieś ciała embrionalne do kultur zawiesinowych na 10 cm nieadhezyjnych szalkach Petriego. Inkubuj je przez pięć dni, zmieniając po pięciu dniach pożywkę co dwa dni.

Przenieś ciała zarodków do zżelatynizowanych szkiełek z ośmioma komorami, umieszczając jedno lub dwa ciała zarodków w każdej komorze. Inkubuj ciała zarodków przez kolejne 10 dni. Po 10 dniach, zmieniając medium co drugi dzień, ostrożnie odessij istniejące medium i dodaj 300 µL roztworu barwiącego komórki Lyo tracker do każdej komory.

Należy ostrożnie odessać pożywkę ręcznie, umieszczając końcówkę pipety w narożniku komory. W ten sposób uniknie się przypadkowego usunięcia ciał, które wciąż przywierają do szklanej powierzchni. Podczas ponownego dodawania pożywki należy umieścić końcówkę pipety w narożniku komory i dodawać pożywkę bardzo powoli.

Inkubuj komory w temperaturze 37°C przez 15 minut. Następnie przemyj je dwukrotnie DPBS, płucząc przez pięć minut podczas każdego przemycia. Teraz utrwal komórki w 4% paraldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń utrwalacz za pomocą DPBS, wykonując dwa pięciominutowe płukania. Aby zamontować embriony, umieść je na szkiełku przedmiotowym z wgłębieniem lub w małej płytce Petriego. Przygotuj próbki komórkowe do mikroskopii, odsysając DPBS.

Zdejmij komorę z preparatu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez około pięć minut. Przykryj folią, aby chronić fluorofory. Następnie dodaj wodny medium montażowe, taki jak Vector Shield z DAPI, i nałóż na wierzch szkiełko cover slip.

Preparat został zamontowany i jest gotowy do obrazowania. Próbki należy wizualizować za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub złożonego, wyposażonego w filtr ROD, domine lub Texas red. Barwienie jest zazwyczaj dość intensywne, więc w trybie manualnym długie czasy naświetlania zazwyczaj nie są konieczne.

Wykonaj cyfrowe zdjęcia wszystkich próbek przy tych samych warunkach ekspozycji. Aby przeprowadzić analizę ilościową obrazów, otwórz je w programie Adobe Photoshop lub podobnym programie do obróbki obrazu. W celu określenia stopnia barwienia lyo trackerem wybierz kanał czerwony.

Zanotuj liczbę pikseli dla całego obrazu, wyświetloną przez funkcję histogramu. Następnie przeprowadź progowanie obrazu w taki sposób, aby czerwone zabarwienie zostało przedstawione białymi pikselami. Operacja ta konwertuje obraz na czarno-biały.

Wybierz poziom progu i zastosuj go do wszystkich obrazów w zestawie. Zaznacz białe piksele za pomocą narzędzia zakresu kolorów (color range), a następnie użyj funkcji histogramu, aby uzyskać całkowitą liczbę białych pikseli. Wykorzystaj kanał niebieski do policzenia liczby jąder komórkowych w polu widzenia.

Przydatne może być prowadzenie rejestru zliczeń poprzez adnotowanie obrazu, zapisywanie wartości i wykorzystanie ich do obliczenia średniego poziomu barwienia na komórkę. Powtórz tę analizę z tym samym ustawieniem progu dla wszystkich pozostałych obrazów. Do pobrania próbek wykorzystano LyO Tracker do barwienia embrionów mutantów sonic hedgehog.

Ponieważ ly O tracker jest małą, łatwo dyfundującą cząsteczką, obszary głęboko wewnątrz całego zarodka barwionego w 10,5 dnia po kopulacji wykazały znaczny wzrost zaprogramowanej śmierci komórki (PCD) w embrionach z mutacją null genu sonic hedgehog, szczególnie w regionach kończyn i somytów. Pączki kończyn obrazowano w preparatach całych przy większym powiększeniu w celu oceny ogólnego wzorca. Wypreparowane fragmenty poddano również cięciu za pomocą wibracyjnego mikrotomu.

Grot strzałki wskazuje na zwiększone barwienie w dystalnej końcówce u embrionów z knockoutem sonic hedgehog w przekrojach wykonanych za pomocą kriostatu. W tych plastrach barwienie TUNEL zastosowano w połączeniu z LysoTracker; mimo że nie występuje ścisła korelacja jeden do jednego między barwieniem LysoTracker a TUNEL, ogólne obszary PCD w znacznym stopniu nakładają się na siebie przy większym powiększeniu. Można zaobserwować komórki, które wybarwiły się dodatnio w teście TUNEL, ale nie w LysoTracker, komórki barwiące się wyłącznie LysoTrackerem oraz komórki z nakładającymi się obydwoma barwieniami. Po 10 dniach hodowli ciała embrionów komórki zróżnicowały się w różnorodne typy komórek, w tym neurony, komórki mięśniowe i kardiomiocyty.

W normalnej hodowli zróżnicowanych komórek ES występuje kilka komórek, które uległy PCD, co wykryto za pomocą testów lyo tracker i tunnel. Następnie komórki poddano działaniu nadtlenku wodoru w celu wywołania śmierci komórkowej wskutek stresu oksydacyjnego. Niska dawka nadtlenku wodoru zwiększyła intensywność barwienia lyo tracker i tunnel w porównaniu do grupy bez zastosowania leczenia.

Podobnie jak w wynikach dla zarodka, oba barwienia objęły zarówno komórki wspólne, jak i unikalne. Wysoka dawka nadtlenku wodoru spowodowała kurczenie się komórek oraz bardziej rozległą pozytywność dla znacznika OT i tunelu. Dla porównania, w celu indukowania autofagii zastosowano głodówkę surowiczą przez jedną godzinę.

Zbarwienie trackera OT wzrosło. Jednakże odsetek komórek TUNEL-dodatnich pozostał na normalnym poziomie. Zatem, choć metoda reer jest łatwa i użyteczna, ważne jest przeprowadzenie dodatkowych analiz po kwantyfikacji próbek, aby ustalić, czy barwienie reprezentuje apoptozę czy autofagię.

Stosując prostą metodę w programie Photoshop, zaprezentowaną wcześniej, wyniki potwierdziły, że zwiększanie stężeń nadtlenku wodoru prowadziło do wyższego poziomu barwienia LysoTracker. Po opanowaniu techniki, procedura barwienia ta może zostać przeprowadzona w czasie krótszym niż dwie godziny, pod warunkiem właściwego postępowania zgodnie z instrukcją. W celu potwierdzenia rodzaju śmierci komórkowej można zastosować inne metody, takie jak barwienie immunocytochemiczne NX-5 lub LC-3. Należy pamiętać, że obecnie LysoTracker Green działa tylko na żywych komórkach, dlatego w przypadku próbek wymagających fiksacji najlepszym wyborem jest LysoTracker Red.