Miksery mikrofluidyczne do badania fałdowania białek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybkie zmieszanie dwóch roztworów w celu zainicjowania reakcji biochemicznej w skali mikrosekundowej. Jest to realizowane poprzez najpierw wykonanie mikropłynnego mieszalnika. Drugim krokiem jest połączenie płytki ze szkiełkiem przykrywkowym w celu uszczelnienia kanałów.

Następnie chip zostaje zamocowany do kolektora zawierającego zbiorniki z roztworami. Ostatnim krokiem jest obrazowanie zmieszanego roztworu przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. W rezultacie reakcja biochemiczna zostaje zarejestrowana w skali mikrosekundowej poprzez przeliczenie odległości wzdłuż kanału wylotowego na czas.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mieszanie stop-flow, jest fakt, że mieszanie nie jest ograniczone przez turbulencje i zachodzi w ciągu kilku mikrosekund. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny zwijania białek, takie jak: kiedy następuje kolaps hydrofobowy? Procedurę zademonstruje Ling Woo, postdoc w moim laboratorium, rozpoczynając proces wytwarzania mikrofluidycznych chipów do mieszania.

W pierwszej kolejności oczyść czterocalowe wafle krzemowe FU świeżym roztworem piranha, zgodnie z opisem w protokole pisemnym towarzyszącym temu filmowi. Następnie, przy użyciu pieca do niskociśnieniowego chemicznego osadzania z fazy gazowej, nanieś powłokę polikrzemową o grubości około jednego mikrona na każde planowane 10 mikronów głębokości końcowych kanałów mikrofluidycznych. Po dalszej obróbce wafli opisanej w tekście, nanieś na nie metodą spin-coatingu warstwę fotorezystu Z 52 14 o grubości 900 nanometrów, a następnie przeprowadź wstępne wypiekanie w temperaturze 90 stopni Celsius bezpośrednio na płycie grzejnej przez jedną minutę lub w piecu w temperaturze 110 stopni Celsius przez 30 minut.

Po wyrównaniu maski fotograficznej należy zapewnić twardy kontakt próżniowy, naświetlając początkowo fotorezyst światłem UV przez kilka sekund. Następnie należy wywołać wzór w fotorezyście zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Elementy na płytce krzemowej należy sprawdzić pod mikroskopem, a następnie przeprowadzić wygrzewanie końcowe w temperaturze 115 °C bezpośrednio na płycie grzejnej przez dwie minuty.

Następnie przeprowadź proces DCU wafli za pomocą urządzenia Asher lub plazmy tlenowej przez 2,5 minuty przy mocy RF wynoszącej 100 watów. Używając głębokiego trawienia jonowego (DRIE), wytraw warstwę polikrzemionową w całości, aż do znajdującej się poniżej krzemionki topionej. Usuń pozostałości fotorezystu i potraktuj wafel zgodnie z instrukcjami zawartymi w tekście.

Zmierz głębokość trawienia, aby upewnić się, że powłoka poliimideowa została całkowicie przetrawiona. Używając głębokiego trawienia jonowego (DRIE) przeznaczonego do tlenków, wytraw fused silica na głębokość około 10 mikronów na każdy mikron grubości powłoki poliimideowej. Oczyść wafelek w systemie Asher dla matryc przez cztery minuty przy mocy RF 100 W, a następnie usuń polikrzem usuwając go w trawaczu difluorkiem ksenonu. Przed wykonaniem otworów w wafelku, nanieś metodą spin-coatingu nową warstwę fotorezystu o grubości jednego mikrona, aby chronić kanały podczas dalszej obróbki.

Następnie przymocuj wafelek stroną z naniesionymi strukturami do szklanej płytki poświęcalnej za pomocą Aqua Bond 55. Dbając o to, aby w spoiwie nie powstały pęcherzyki powietrza, użyj sterowanej komputerowo wiertarki z diamentowym wiertłem i roztworem czyszczącym micro 90. Zapobiega to przywieraniu małych odłamków szkła do kanałów, co mogłoby doprowadzić do zapchania chipu podczas użytkowania.

Następnie należy wywiercić otwory wejściowe i wyjściowe w każdym chipie. Przemyć wafelek wodą dejonizowaną, używając strzykawki do wstrzyknięcia wody do każdego otworu. Następnie, po usunięciu fotomaski, moczyć w wodzie z mydłem przez godzinę.

Nałożyć rezyst i czynnik wiążący zgodnie z opisem w tekście. Przepłukać wafer wodą dejonizowaną oraz ciepłą wodą z mydłem. Ponownie przepłukać każdy otwór za pomocą strzykawki, unikając kontaktu z wytrawionymi strukturami po przedmuchaniu wafera azotem.

Kontynuuj suszenie w piecu próżniowym ustawionym na 120 °C. Sprawdź otwory, aby upewnić się, że są wolne od zanieczyszczeń, i w razie potrzeby powtórz etapy czyszczenia. Następne kroki należy wykonać w pomieszczeniu czystym.

Zmierz głębokość kanałów za pomocą optycznego lub mechanicznego profilometru powierzchniowego. Oczyść wafelek oraz pokrycie szklane z topionego kwarcu zgodnie z opisem w tekście w pomieszczeniu czystym (clean room). Thoroughly wysusz wafelek prądem gazu azotowego przez co najmniej pięć minut.

Następnie należy położyć wafelek stroną z naniesionymi strukturami do góry na stosie trzech do czterech chusteczek do czystych pomieszczeń, umieszczonych na twardej, płaskiej powierzchni, takiej jak mała tafla szkła. Powtórz tę czynność z deactivate szkiełkiem podstawowym. Chwyć szkiełko podstawowe za krawędź i odwróć je tak, aby strona polerowana znajdowała się skierowana w dół nad waflekiem.

Ostrożnie wyrównaj płaskie krawędzie, upuść szkiełko przykrywowe na wafer i poczekaj, aż osiądzie, przesuwając go wyłącznie w poziomie w celu skorygowania wyrównania. Jednym palcem naciśnij środek wafera. Powinien pojawić się front wiązania, który zacznie rozprzestrzeniać się na zewnątrz.

W razie potrzeby należy wywrzeć dodatkowy nacisk w innych miejscach wokół wafla, aby przesunąć front wiązania. Po umieszczeniu szczelnie zamkniętych wafli w piecu wysokotemperaturowym zaprogramowanym zgodnie z profilem temperatury opisanym w tekście, należy pociąć wafel za pomocą piły do wafli na pojedyncze chipy. Kolektor do utrzymania chipa mieszającego i roztworów może być wykonany z tworzywa sztucznego, takiego jak lexan lub pleksiglas, lub z aluminium.

W celu kontroli temperatury przymocuj chip do kolektora za pomocą małych o-ringów i utrwal go pierścieniem zabezpieczającym, który zapewnia niezakłócony widok optyczny centrum chipa. Rowki pod o-ringi powinny być płytsze niż standardowo, aby zapewnić szczelne dopasowanie bez wywierania nadmiernego nacisku na chip. Po zamontowaniu chipa dodaj roztwory do zbiorników centralnego i bocznych, dbając o usunięcie wszelkich pęcherzyków powietrza uwięzionych na dnie studzienek.

Umieść rozdzielacz na odwróconym mikroskopie i zbadaj obszar mieszania za pomocą okularu lub wyjścia z kamery. Latarka żarowa umieszczona na górze rozdzielacza zapewni wystarczające oświetlenie. Aby zobaczyć strumień, zastosuj barwnik lub roztwór o wysokim współczynniku załamania światła w kanale centralnym.

Ponieważ objętości stosowane w tym mieszalniku są bardzo małe, przepływem można sterować za pomocą ciśnienia powietrza przyłożonego nad studzienkami z roztworem. Aby zwizualizować strumień, należy rozpocząć od ciśnienia w kanale bocznym wynoszącego zero psi i powoli zwiększać je, aż zrówna się z ciśnieniem w kanale środkowym. Jeśli jeden z kanałów bocznych jest zapchany, strumień zostanie pchnięty w stronę jednej ze ścianek kanału wylotowego.

Jeśli pojawi się widoczny zator, można go usunąć, przykładając ciśnienie lub próżnię do kanału wyjściowego za pomocą strzykawki. W przypadku zablokowania chipa przez białka lub inny materiał organiczny, można go oczyścić, namaczając w roztworze pirania przez całą noc. Wprowadź skupioną wiązkę laserową do mikroskopu klasy badawczej, używając lustra dichroicznego umieszczonego wewnątrz lub bezpośrednio na zewnątrz mikroskopu.

Ustaw laser w taki sposób, aby ogniska było widać w okularze lub na kamerze w pobliżu obszaru mieszania. Fluorescencja białka w mieszalniku jest zbierana przez obiektyw i przesyłana przez lustro dichroiczne, skupiana przez soczewkę w otworze udiernikowym (pinhole) i obrazowana na liczniku fotonów. Przeskanuj chip za pomocą skanera piezoelektrycznego w osiach x i y, aby uzyskać obraz obszaru mieszania.

Wybierz pozycję na strumieniu i wykonaj skanowanie w osiach X i Y, aby odnaleźć ognisko w centrum kanału w płaszczyźnie pionowej. Głębia ostrości mikroskopu jest znacznie mniejsza niż głębokość kanału, a szybkość przepływu w kanale jest jednorodna, z wyjątkiem obszaru w odległości jednego mikrona od ścianek. Zatem rozdzielczość czasowa obserwowanej fluorescencji jest określana przede wszystkim przez rozmiar plamki konfokalnej.

Wykonaj skanowanie poziome w kanale wylotowym w odstępach 100 micronów wzdłuż strumienia, obserwując każdą pozycję przez około jedną milisekundę. Przesuń stolik mikroskopu o 80 do 90 micronów wzdłuż strumienia, aby zarejestrować późniejsze punkty czasowe. Alternatywnie światło może być detektowane przez spektrograf i CCD za lustrem dichroicznym, przy użyciu soczewki skupiającej światło na szczelinie wlotowej.

Ponieważ zbieranie danych jest wolniejsze niż w przypadku licznika fotonów, zazwyczaj najpierw wykonuje się obrazowanie strumienia za pomocą licznika fotonów, a następnie mierzy się punkty wzdłuż strumienia za pomocą spektrografu. Dane z licznika fotonów analizuje się poprzez sumowanie od trzech do pięciu pikseli wokół strumienia w każdej pozycji, aby utworzyć wykres intensywności w funkcji odległości. Czas oblicza się na podstawie odległości, wykorzystując prędkość wyliczoną z przyłożonych ciśnień.

W ramach ostatniego kroku należy przeanalizować dane ze spektrografu, korzystając z jednej z metod opisanych w tekście. Przedstawiono tutaj wykres konturowy natężenia w obszarze mieszania, zmierzonego za pomocą licznika fotonów. Tło w kanale wylotowym poza strumieniem powinno być bliskie poziomowi szumów detektora i zazwyczaj nie jest odejmowane.

Wyższe tło może wskazywać na niewłaściwe wyrównanie lub na to, że białko przywiera do ścianek kanału. I odwrotnie, strumień, który wygląda na załamany lub skrzywiony, szczególnie w pobliżu obszaru mieszania, świadczy o złym wytrawieniu dysz. Przedstawiono widmo rozdzielone w czasie dla białka ACell coenzyme a binding protein lub A CBP znakowanego barwnikami Alexa 4 88 i Alexa 6 47.

Zielone i czerwone prostokąty wskazują długości fal przypisane odpowiednio do kanałów donora i akceptora. Z danych tych odjęto tło, aby usunąć prąd ciemny oraz sygnał laserowy. Sygnał tła zarejestrowano przy ciśnieniu w kanale środkowym wynoszącym zero funtów na cal kwadratowy.

Czas mieszania można określić poprzez pomiar szybkiej reakcji, która przebiega znacznie szybciej niż proces mieszania, takiej jak gaszenie fluorescencji tryptofanu przez jodek potasu. Ponieważ strumień jest mniejszy niż rozdzielczość optyczna mikroskopu, w obszarze mieszania występuje znaczny spadek intensywności. W momencie formowania się strumienia odpowiedź aparatury można usunąć, wykonując pomiar kontrolny, w którym nie zmieniono warunków roztworu.

Na rysunku przedstawiono stosunek eksperymentów z mieszaniem i bez mieszania dla fluorescencji N-acetylotryptofanu. Linia wskazuje przewidywane stężenie jodku potasu uzyskane z modelowania i symulacji w programie COMSOL Multiphysics. Czas mieszania, mierzony jako czas potrzebny do spadku stężenia o 80%, wynosi osiem mikrosekund.

Wykres ten przedstawia zmiany FRET w białku A CBP po rozcieńczeniu denaturatora z stężenia 6 M do 0,06 M. Dane te nie wymagają przeprowadzenia eksperymentu kontrolnego. Ponieważ FRET jest już wartością względną, a odpowiedź instrumentu została usunięta, gwałtowny skok w pobliżu T równym zero reprezentuje szybką zmianę sygnału FRET w czasie mieszania.

Po tym osiągnięciu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się zwijaniem białek do analizy najwcześniejszych etapów formowania się struktury białek.