Iteracyjna optymalizacja dupleksów DNA w celu krystalizacji kompleksów SeqA-DNA

Niniejszy eksperyment szczegółowo opisuje sposób otrzymywania kryształów białka związanego z DNA zawierającym tandemowo półmetylowane sekwencje GATC o jakości dyfrakcyjnej. Powtórzenia mają na celu sprzyjanie upakowaniu kryształów kompleksu białko-DNA. Procedurę rozpoczyna się od racjonalnego zaprojektowania długości DNA, odstępów GATC oraz końców DNA, następnie wykorzystuje się komplementarne jednoniciowe oligonukleotydy do oczyszczenia DNA, a następnie przeprowadza anelowanie w celu utworzenia półmetylowanego dupleksu DNA, po czym dodaje się oczyszczone białko seq A w celu utworzenia kompleksu.

Następnie należy dobrać optymalne warunki do hodowli kryształów kompleksu białko-DNA o jakości dyfrakcyjnej, przeprowadzając próby krystalizacji z użyciem komercyjnych ekranów matryc rzadkich (sparse matrix screens). Przedstawiono uzyskane wyniki. Omówiono wpływ zmiennej długości DNA, odstępów GATC oraz końców na jakość dyfrakcyjną kryształów CQ A DNA.

Celem niniejszej pracy jest otrzymanie kryształów CK związanej z DNA o jakości dyfrakcyjnej, jednak może ona również pomóc w zrozumieniu ogólnych zmiennych, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania dupleksów DNA do krystalizacji innych kompleksów białkowo-DNA; procedura ta zostanie wykorzystana przez Chang, A, doktoranta z mojego laboratorium. W badaniu tym zastosowano wariant białek regulacyjnych replikacji DNA. Wykorzystano wariant, który tworzy stabilne dimery i posiada skrócony region łącznika pomiędzy domeną oligomeryzacji a domeną wiążącą DNA.

Ten wariant ogranicza wiązanie DNA do tandemowych powtórzeń GATC oddzielonych wyłącznie jednym zakrętem helisy DNA. Najpierw dokonano transformacji komórek BBL 20 1D3 plazmidem kodującym DEMETRIC seq A pod kontrolą promotora T7. Reakcję transformacji wysiano na płytki z agarem LB zawierającym 100 µg/mL ampicyliny i inkubowano w inkubatorze bakteryjnym przez noc. Wybrano mieszane kolonie i przystąpiono do hodowli nocnej w małej skali.

Następnego dnia zaszczepić jeden litr kultury za pomocą 10 ml nocnego inokulum. Gdy kultura osiągnie fazę logarytmiczną, dodać dwa ml 0,5 M IPTG w celu indukcji produkcji białka. Kontynuować inkubację przez trzy godziny w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną w temperaturze 37 °C.

Następnie zebrać komórki poprzez wirowanie przy 3 300 G przez 10 minut. Przesuspender pellet komórkowy w buforze do oczyszczania A za pomocą sonikacji, a następnie oczyścić lizat poprzez wirowanie przy 39 000 ×g przez 40 minut. Teraz nałożyć supernatant na kolumnę z heparyną wyrównaną buforem do oczyszczania.

Aby wyeluować białko CK. Należy zastosować gradient liniowy do 1 M NaCl; białko CK eluiuje przy stężeniu około 0,7 M NaCl. Należy zebrać frakcje zawierające CK i rozcieńczyć je, aby obniżyć siłę jonową próbki.

Następnie nałóż próbkę na kolumnę do chromatografii wymiany kationowej E wyrównaną buforem oczyszczającym. Zastosuj liniowy gradient soli, aby wyeluować czyste białko CK przy stężeniu chlorku sodu około 0,4 M. Połącz frakcje zawierające CK.

Skoncentrować do 3 mg/mL i przechowywać w odpowiednich warunkach. Zaprojektować bufor oraz komplementarne oligonukleotydy niezmetylowane i zmetylowane. Przygotować próbki zawierające 1 µmol każdego liofilizowanego pojedynczego pasma DNA w 800 µL autoklawowanej wody dwukrotnie destylowanej, wymieszać w wir器u i odstawić na 15 minut, a następnie dodać kolejne 800 µL.

Do każdej próbki dodaj podgrzany bufor do ładowania 2x; dla oligonukleotydów o długości od 20 do 30 nukleotydów przygotuj duży 10% żel denaturujący. Po polimeryzacji wyjmij grzebień i dokładnie wypłucz oczka. Złóż układ żelowy, napełniając górny i dolny zbiornik buforem do elektroforezy 1x TBE.

Przeprowadź wstępną elektroforezę żelu przy napięciu 750 V, aby rozgrzać go do 55 °C. Następnie przerwij bieg i dokładnie wypłucz oczka buforem do elektroforezy. Teraz podgrzej oligonukleotydy do 90 °C przez dwie minuty.

Wymieszaj na wortexie i odwiruj. Próbki należy niezwłocznie nanieść na żel. Prowadź elektroforezę przy napięciu około 700 V aż do czasu migracji oligonukleotydu.

W połowie żelu poliakrylamidowego 10% alph phenol blue współmigruje z oligonukleotydami o długości około 20 zasad, a xylene syl ff z tymi o długości około 60 zasad. Wyjmij żel z aparatury i zdejmij dystanse na płaskiej powierzchni. Usuń jedną płytkę szklaną i przykryj żel folią spożywczą.

Następnie odwróć żel, zdejmij drugą płytkę szklaną i przykryj żel folią spożywczą. Dalej, zaznacz prążki, wykorzystując światło UV i płytkę fluorescencyjną umieszczoną za żelem. Aby widzieć cień DNA, wytnij prążek za pomocą żyletki i podziel go na małe kawałki.

Przenieś każdą próbkę do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj dziewięć mililitrów buforu elucyjnego i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C przy jednoczesnym mieszaniu. Ostrożnie przenieś roztwór do probówki do wirowania odpornej na autoklawowanie, używając końcówki do pipetowania żeli.

Aby uniknąć przeniesienia fragmentów akrylamidu, należy dodać 1 ml 3 mM octanu sodu o pH 7 oraz 25 ml schłodzonego 100% etanolu i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej trzy godziny. Następnie odwirować osad DNA. Osady wysuszyć w wirówce odparowującej (SpeedVac) przy średniej temperaturze, po czym każdy z nich zawiesić w 400 µl autoklawowanej, dwukrotnie destylowanej wody i przenieść do nowej probówki.

Dodać 40 µL 3 M octanu sodu o pH 7 oraz 1 ml 100% etanolu, wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować przez 30 minut w temperaturze -20 °C, a następnie centryfugować przez 15 minut przy 18 000 ×g. Osad DNA przemyć 100 µL zimnego 70% etanolu w celu usunięcia resztek soli, a następnie wirować przez 6 minut przy 18 000 ×g. Po odlaniu etanolu osad wysuszyć w koncentratorze próbek SpeedVac.

Następnie każdy osad resuspenduj w 100 µl autoklawowanej wody podwójnie destylowanej. Wyznacz stężenie oligonukleotydów metodą spektrometrii. Aby przygotować hemi-metylowane dupleksy DNA, najpierw zmieszaj równe stężenia molowe komplementarnych pojedynczych nici.

Następnie podgrzej mieszaniny do 95 °C w kąpieli wodnej przez pięć minut, aby zdenaturować nici. Pozostaw próbki do powolnego ochłodzenia w temperaturze pokojowej wewnątrz kąpieli wodnej. Połącz równe objętości 81 µM oczyszczonego białka CQ oraz 81 µM hemimetylowanego DNA.

Następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu zastosowania ekranów warunków krystalizacji przy użyciu komercyjnych ekranów rzadkiej macierzy. Po zidentyfikowaniu wstępnych warunków prowadzących do krystalizacji, zoptymalizować warunki w celu wyhodowania kryształów o jakości dyfrakcyjnej. Przechowywać i chronić powstałe kryształy CK DNA przed wysychaniem.

Należy zwiększyć ilość PEG 400 w roztworze krystalizacyjnym do stężenia końcowego 25% lub dodać 20% glicerolu do roztworu krystalizacyjnego. Pojedyncze kryształy należy pobrać za pomocą nylonowej pętli. Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie.

Następnie należy sprawdzić granicę dyfrakcyjną każdego kryształu w temperaturze 100 k. Aby uzyskać strukturę krystaliczną skróconego mutanta CK związanego z hemimetylowanym DNA, kolejno optymalizujemy trzy parametry DNA: odstęp między hemimetylowanymi sekwencjami GATC, długość dupleksu oraz brak lub obecność nawisów 5'. W badaniu tym zastosowano wariant DME seek a z mutacją punktową w domenie terminalnej końca, która zapobiega dalszej ligandacji, oraz skrócony łącznik, który ogranicza wiązanie DNA do formy tandemowej.

Analizy przesunięcia elektromobilności DNA wykazały, że powtórzenia GATC oddzielone wyłącznie jednym zwodem helisy wskazują, iż zmodyfikowane białko CK wiąże preferencyjnie powtórzenia GATC oddzielone od siebie od dziewięciu do 10 par zasad. W związku z tym w wstępnych badaniach przesiewowych wykorzystano dupleksy o długości od 23 do 24 par zasad, zawierające dwa hemimetylowane powtórzenia GATC oddzielone od siebie dziewięciu lub 10 parami zasad.

Trzy dupleksy pozwoliły na uzyskanie kryształów o ładnych kształtach. Choć żaden z kryształów nie dyfrakował do wysokiej rozdzielczości, dane wskazały, że preferencyjny dla krystalizacji był odstęp dziewięciu par zasad A-G-A-T-C; nieoczekiwanie, zwiększenie oddziaływań szkieletu w bruździe poprzez wprowadzenie dinukleotydu CG pomiędzy dwa miejsca GATC nie zmieniło granicy dyfrakcji kryształów.

W przeciwieństwie do tego, optymalizacja długości nawisów drastycznie zmieniła kontakty molekularne oraz morfologię kryształów. Struktura krystaliczna tego białka CK związanego z hemimetylowanym dupleksem DNA potwierdziła, że wolna powierzchnia dupleksu DNA nie bierze udziału w kontaktach krystalicznych; mimo względnej wielkości białka i DNA, większość oddziaływań między symetrycznymi partnerami jest pośredniczona przez interakcje białko-białko oraz białko-DNA. Co ciekawe, w tym konkretnym przypadku korzystny efekt nawisu dinukleotydowego na końcu 5' nie wynika z utworzenia pseudociągłego DNA.

Zamiast tego, koniec 5' zmetylowanej nici wystaje poza osie DNA i oddziałuje z proksymalną cząsteczką CK kompleksu, co wyjaśnia, dlaczego do zmiany upakowania kryształów niezbędne były dokładnie dwa nukleotydy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat oczyszczania białek oraz projektowania dupleksów DNA do krystalizacji kompleksów białkowo-DNA. Należy pamiętać, że choć niniejszy protokół opracowano w celu krystalizacji kompleksu CK-DNA, racjonalna optymalizacja długości, sekwencji i końców DNA stanowi ogólne ramy projektowania dupleksów DNA do krystalizacji innych kompleksów białkowo-DNA.