Wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji RNA do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

Niniejszy film prezentuje procedurę identyfikacji genów regulujących wzrost i wielkość ciała u C. elegans. W celu inaktywacji genów kandydackich za pomocą interferencji RNA (RNAi), w pierwszej kolejności przygotowuje się płytki zawierające bakterie ekspresyjne dwuniciowego RNA, który jest skierowany przeciwko badanym genom. Następnie hermafrodyty w czwartym stadium larwalnym są przenoszone na płytki RNAi.

Po osiągnięciu stadium młodego dorosłego osobniki są przenoszone na nowe płytki RNAI w celu zniesienia jaj. Po kilku godzinach są one usuwane, co pozwala na uzyskanie zsynchronizowanych populacji embrionów. Na pożądanym etapie rozwoju potomstwo jest zbierane i mocowane na szkiełkach przedmiotowych.

Na koniec pozyskuje się obrazy mikroskopowe nicieni. Analiza obrazu wykazuje zmiany w wielkości ciała spowodowane inaktywacją genów. Choć metodę tę można wykorzystać do identyfikacji regulatorów szlaku sygnalizacyjnego TGF beta, można ją również zastosować do innych szlaków regulujących rozwój pozazarodkowy u C. elegans, takich jak szlak sygnalizacyjny insuliny.

Procedurę rozpoczyna się od sklonowania docelowych sekwencji genów do wektora L 4 4 4 0 A, będącego powszechnie stosowanym plazmidem do RNAi u nicieni, a następnie transformacji rekombinowanego plazmidu do szczepu bakteryjnego HT one 15 DE three. Przekształcone bakterie wysiewamy na płytki z agarem LB zawierającym 25 µg/mL karbenicyliny i 12,5 µg/mL tetracykliny, po czym wybieramy pojedynczy klon do dalszego wykorzystania.

W międzyczasie należy wprowadzić pusty wektor L 4 4 4 0 do szczepu bakteryjnego HT one 15. Aby wykorzystać go jako kontrolę do eksperymentów, bakterie po transformacji należy hodować przez noc w 1 ml bulionu LB z dodatkiem 100 µg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C.

Tetracykliny nie dodaje się, ponieważ obniża ona wydajność RNAI. Do hodowli nocnej dodaje się kolejne 5 ml bulionu LB z 100 µg/ml ampicyliny, a następnie inkubuje przez kolejne 4–6 godzin w temperaturze 37 °C. Po przygotowaniu hodowli, 0,5 ml bakterii doświadczalnych lub kontrolnych wysiewa się na płytki z nicieniami RNAI oznakowane odpowiednią nazwą klonu.

Dla każdego wariantu należy przygotować co najmniej dwie płytki. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia.

Należy przygotować trawnik bakterii wykazujących ekspresję RNAi z sekwencją genu docelowego lub bez niej. Zwierzęta będą wykorzystywać bakterie jako źródło pożywienia. Po przygotowaniu płytek do karmienia RNAi, końcówkę drutu platynowego należy wysterylizować w płomieniu.

Następnie za pomocą platynowej igły przenieś od sześciu do dziesięciu hermafrodyt *C. elegans* w czwartym stadium larwalnym (L4) na każdą płytkę z RNAi. Pozostaw hermafrodyty do wzrostu w temperaturze 20°C przez noc. Następnego dnia zwierzęta będą w stadium młodych osobników dorosłych.

Przenieś je na nową, odpowiednio opisaną i przygotowaną płytkę RNAI. Inkubuj płytki w temperaturze 20 °C przez cztery do sześciu godzin, aby umożliwić osobnikom dorosłym zniesienie jaj. Po inkubacji usuń wszystkie osobniki dorosłe z płytki w celu synchronizacji potomstwa.

Po usunięciu osobników dorosłych należy rozpocząć pomiar czasu. Jest to moment zero. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C, aby zwierzęta osiągnęły interesujący nas stopień rozwoju.

W tym etapie do analizy fenotypowej zostaną wybrane młode dorosłe osobniki. W przypadku wyciszeń genów, w których rozwój przebiega w normalnym tempie, wymagana jest 72-godzinna inkubacja. Należy pamiętać, że różne geny w odmienny sposób wpływają na rozwój zwierząt, dlatego czasy inkubacji mogą wymagać dostosowania.

Jeśli RNAi powoduje, że zwierzęta rosną w innym tempie, młode osobniki dorosłe można zidentyfikować jako te, które nie przekroczyły 24 godzin od stadium L4, z zakończonym rozwojem VUL oraz od dwóch do sześciu embrionów w macicy, jak pokazano tutaj. W celu identyfikacji innych etapów rozwojowych badacz powinien kierować się rozwojem gonad i VUL. Po osiągnięciu przez zwierzęta odpowiedniego stadium należy przygotować się do oceny fenotypów wielkości ciała nicieni poddanych działaniu RNAi.

Następnie naklej dwie warstwy kolorowej taśmy etykietującej na szklany przedmiot szkiełko o grubości jednego milimetra, jak pokazano tutaj. Przygotuj dwa takie szkiełka. Następnie umieść nowe szkiełko pomiędzy dwiema płytkami z taśmą i nanieś kroplę 2% Agros rozpuszczonego w wodzie.

Na środek nowej szkiełka przedmiotowego dociśnij drugie szkiełko, aby utworzyć cienką podkładkę z agarozy. Po zestaleniu się agarozy zdejmij górne szkiełko. Szkiełko z podkładką z agarozy jest gotowe do naniesienia nicieni.

Oznacz preparat nazwą klonu. Do podkładki aros dodaj 10 µL 25 mM azydku sodu. Następnie, używając platynowej igły jak poprzednio, przenieś od 30 do 40 osobników do roztworu azydku sodu.

Aby je unieruchomić, nałóż na wierzch szkiełko zakrywkowe. Powtórz tę czynność zarówno w przypadku zwierząt rekombinowanych, jak i zwierząt z pustym wektorem L 4 4 4 0 poddanych działaniu RNAi. Następnie umieść preparat z mikrometrem pod mikroskopem stereoskopowym z obiektywem 2,5 x.

Używając oprogramowania Q Capture lub podobnego, należy wykonać zdjęcie mikrometru i zapisać je. Następnie należy umieścić nicienie pod mikroskopem i wykonać ich zdjęcia. Aby zmierzyć długość ciała, należy w pierwszej kolejności otworzyć zdjęcie mikrometru w oprogramowaniu Image Pro.

Następnie kliknij „measure” i wybierz „calibration”. Następnie wybierz „spatial Calibration wizard”, zaznaczając opcję „calibrate the active image”. Kliknij „next”.

Wprowadź nazwę kalibracji i upewnij się, że jednostki odniesienia przestrzennej są ustawione na mikrony. Następnie zaznacz przycisk Utwórz kalibrację referencyjną i kliknij Dalej. Kliknij przycisk narysuj linię referencyjną.

Pojawi się referencyjny pasek skali. Przesuń pasek skali tak, aby odpowiadał końcom mikrometru. Następnie wskaż, że referencja odpowiada 1000 jednostkom.

Kliknij OK. Następnie wybierz „Dalej” i „Zakończ”. Po skalibrowaniu oprogramowania otwórz obraz nicienia.

Następnie w menu Measure wybierz opcję Calibration, a potem kliknij Select Spatial. Z menu rozwijanego wybierz nazwę pliku utworzonego podczas kalibracji mikrometrem. Następnie w menu Measure, w otwierającym się oknie, wybierz opcję Measurements.

Wybierz narzędzie rysowania swobodnego i za pomocą myszy komputerowej poprowadź linię przez środek ciała zwierzęcia, od głowy do ogona. Długość zostanie wyświetlona w oknie. Powtórz ten proces dla wszystkich zwierząt w polu widzenia.

Wyeksportuj pomiary długości do pliku Microsoft Excel lub innego odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Przeanalizuj dane, obliczając średnią oraz odchylenie standardowe dla każdej próbki. Następnie porównaj wyniki dla każdej grupy, stosując test t Studenta.

Białko DBL1 z superrodziny czynnika wzrostu transformującego beta (TGF beta) jest niezbędne do aktywacji szlaku TGF beta. W odpowiedzi na aktywację sygnału wewnątrzkomórkowe transduktory sygnału smad przemieszczają się do jądra komórkowego i inicjują transkrypcję genów. U osobników, u których szlak TGF beta jest zaburzony, obserwuje się mniejszy rozmiar ciała, w tym krótszą długość ciała w porównaniu z osobnikami typu dzikiego.

W ten sposób przeprowadzono przesiewy u C. elegans. Mutanty wielkości ciała pozwalają na identyfikację komponentów i modyfikatorów szlaku sygnałowego TGF-beta w celu przetestowania skuteczności RNAi poprzez karmienie w celu identyfikacji mutantów wielkości ciała. RNAi wykorzystano do wyciszenia komponentów szlaku DBL-1, SMA-3 oraz SMA-6 w czterech różnych szczepach C. elegans.

Przetestowane szczepy C. elegans obejmowały dwa nadwrażliwe na RNAi: Lin 15 B oraz RF 3, a także standardowy szczep typu dzikiego N 2 oraz szczep LIN 36, którego wrażliwość na RNAi jest podobna do N 2, jak pokazano tutaj. W przypadku zakłócenia ekspresji SMA 3 lub SMA 6 zwierzęta wykazywały znacznie krótszy rozmiar ciała niż zwierzęta kontrolne, z wyjątkiem RNAi SMA 6 w Lin 36. Tło w RF 3.

Długości ciał osobników młodych dorosłych w grupie kontrolnej po traktowaniu RNAi stanowiły od 84 do 95% długości osobników traktowanych samym wektorem. W przypadku szczepu A one Lin 15 B długości ciał osobników młodych dorosłych po RNAi stanowiły od 68 do 86% długości zwierząt kontrolnych. Jednakże szczep A one lin 15 B daje mniej potomstwa.

To sprawia, że nie nadają się one do przesiewania na szeroką skalę. Dlatego do tych technik sugerowane jest użycie szczepu RF three. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak identyfikować geny regulujące wzrost i wielkość ciała przy użyciu techniki interferencji RNI.