Przygotowanie pęcherzyków F₁F_O ATPase oraz technika rejestracji patch-clamp błon pęcherzyków submitochondrialnych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja pęcherzyków F1 F zero APA z mózgu szczura w celu przeprowadzenia pomiarów metodą patch clamp. Cel ten osiąga się poprzez najpierw wyjęcie mózgu ze szczura i jego homogenizację. Drugim krokiem jest zniszczenie stref synaptycznych poprzez zastosowanie nacisku.

Następnie synaptosomy nanosi się warstwami na gradienty w fiolkach. Ostatnim krokiem jest inkubacja z digitoniną i L w celu uzyskania końcowych pęcherzyków do rejestracji metodą patch-clamp. Ważną funkcją mitochondriów jest produkcja ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej.

Enzymem odpowiedzialnym za produkcję ATP jest syntaza ATP zlokalizowana w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Aby szczegółowo zbadać funkcję syntazy ATP, izolujemy specjalne pęcherzyki submitochondrialne, które nazywamy SMV. Zawierają one enzym syntazę ATP w konfiguracji odwróconej (inside-out).

Następnie rejestrujemy te SMV za pomocą elektrody patch-clamp i określamy przepuszczalność ich błon. Pozwala to ocenić wydajność produkcji TP przez mitochondria. Procedurę tę zaprezentuje dziś Sylvia ti, stażystka podoktorska w moim laboratorium na Uniwersytecie Yale.

W tej procedurze, po pobraniu głowy szczura poprzez dekapitację, należy naciąć skórę, aby odsłonić czaszkę, a następnie ostrożnie otworzyć czaszkę, przecinając ją nożyczkami lub kleszczami Ronsa. Następnie należy wyjąć mózg, posiekać go (bez móżdżku), a w końcowym etapie wyizolować w buforze, po czym przenieść do szklanego homogenizatora teflonowego o pojemności 5 mL. Należy delikatnie homogenizować tkankę 10 razy, co zajmuje łącznie około pięciu minut. Po tym czasie próbkę należy odwirować w wirówce laboratoryjnej z prędkością 1 500 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

Należy zachować nadsącz zawierający mitochondria i synaptosomy, a osad odrzucić. Następnie próbkę należy ponownie odwirować w wirówce laboratoryjnej przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie należy odlać nadsącz i zawiesić osad w 500 µL buforu izolacyjnego. Synaptosomy należy rozbić za pomocą naczynia do homogenizacji komórek, stosując ciśnienie 1 200 PSI przez 10 minut, a następnie gwałtownie je rozprężyć. Rozbite synaptosomy należy nanieść na probówki do wirowania z dwiema różnymi koncentracjami FiCoL, co spowoduje utworzenie dwóch warstw.

Następnie umieść probówki w wirniku SW 50.1 i wiruj przy 126 500 ×g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Osadem w ultrawirówce są oczyszczone mitochondria. Warstwa pomiędzy różnymi gęstościami w probówce to nieuszkodzone synaptosomy.

Następnie wypłucz osad, wirując go w buforze izolacyjnym przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce laboratoryjnej. Teraz resuspenduj mitochondria w 200 µL buforu izolacyjnego połączonego z równą objętością 1% digitoniny.

Umieścić na lodzie na 15 minut. Następnie dodać więcej buforu izolacyjnego i odwirować z prędkością 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Powtórzyć tę procedurę dwukrotnie, a następnie zawiesić osad w 200 µL buforu izolacyjnego, dodać 2 µL 10% mieszaniny Lybra PX i pozostawić na lodzie na 15 minut.

Następnie nałóż warstwami mieszaninę z izolatem oraz bufor do probówek wirówkowych. Umieść probówki w rotorze SSW 50.1 i wiruj przy 182 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsius za jedną godzinę. Po godzinie.

Przemyj końcowy osad, wirując go w buforze izolacyjnym przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Typowe stanowisko do elektrofizjologii obejmuje wzmacniacz, komputer PC wyposażony w DigiData 1440, interfejs przetwornika analogowo-cyfrowego współpracujący z oprogramowaniem pCLAMP 10.0, manipulatory, mikroskop, stół wibroizolacyjny oraz klatkę Faradaya. Najpierw wyciągnij pipetę z kapilary wykonanej z borokrzemianowego szkła, używając mikro-wyciągarki do pipet z ogniem.

Optymalna rezystancja pipety powinna wynosić od 80 do 100 mega ohm. Dodaj pęcherzyki submitochondrialne do fizjologicznego roztworu wewnątrzkomórkowego. Następnie napełnij pipetę do patch-clamp tym samym roztworem.

Wizualizuj pęcherzyki za pomocą mikroskopii w kontraście fazowym po wprowadzeniu SMVs w konfigurację patch-clamp w temperaturze pokojowej. Rejestruj aktywność, utrzymując potencjał błonowy w zakresie od -100 mV do +100 mV przez 10 sekund w każdym okresie.

Zarejestrowane dane są filtrowane z częstotliwością 5 kHz przy użyciu układów wzmacniacza i analizowane za pomocą oprogramowania Clampfit 10.0. Rysunek ten przedstawia analizę western blot lizatu przygotowanego z cytozolu i mitochondriów. Górny panel przedstawia immunoblot z użyciem przeciwciała przeciwko białku cytozolowemu GA dh.

Dolny panel przedstawia analizę Western blot z użyciem przeciwciała przeciwko białku wewnętrznej błony mitochondrialnej Cox four. Przedstawiono tutaj dwa reprezentatywne zapisy techniki patch-clamp przed i po dodaniu 1 mM ATP. Potencjał utrzymujący wynosi +70 mV. Linia przerywana oznacza 0 pA.

Każdy ślad jest rejestrowany przez 10 sekund, a przerwy między wyświetlanymi śladami wynoszą 10 sekund. Przedstawiono tutaj przykładowe ślady zmian intensywności fluorescencji wskaźnika CMA w czasie w obecności SMV oraz w obecności i przy braku TP. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat izolacji mitochondriów oraz pęcherzyków submitochondrialnych zawierających syntazę F1 FO 80 TP. Ponadto powinni Państwo zrozumieć sposób tworzenia odpornej uszczelki z elektrodą na błonie pęcherzyka w celu analizy aktywności kanału kompleksu syntazy ATP.