Ilościowe badanie lokomocji swobodnie pływających mikroorganizmów z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej
25 października 2012
Mikroskopijne organizmy, takie jak wolno pływający nicień C. elegans, żyją i zachowują się w złożonym trójwymiarowym środowisku. Przedstawiamy nowatorskie podejście umożliwiające analizę C. elegans z wykorzystaniem wzorów dyfrakcyjnych. Metoda ta polega na śledzeniu periodyczności czasowej wzorów dyfrakcyjnych generowanych poprzez kierowanie wiązki lasera przez kuwetę.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar częstotliwości ruchów wiciowych (thrashing) swobodnie pływających organizmów mikroskopowych. W tym celu najpierw przygotowuje się próbkę mikroskopijnych nicieni, a następnie konfiguruje układ optyczny.
Następnie rejestrowany jest wzór dyfrakcyjny wprowadzony przez żywe organizmy. Na koniec zarejestrowane dane są analizowane w celu określenia częstotliwości pływania. Ostatecznie analiza dyfrakcyjna służy do wykazania zmian w wzorcach lokomocji nieograniczonych pierścienic.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjna mikroskopia, jest możliwość obserwacji wzorców pływania gatunku poruszającego się swobodnie w przestrzeni trójwymiarowej. Chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o swobodnie pływających osobnikach C. elegans, można ją zastosować również do innych przezroczystych, małych i mikroskopijnych organizmów poddanych różnym warunkom. Aby przygotować C. elegans do analizy wideo, należy najpierw za pomocą spłaszczonego platynowego drutu przenieść od 10 do 20 dorosłych nicieni na świeże podłoże NGM.
Płytki Petri z agarem zawierające małe, okrągłe plamki E. coli. Pozostawić nicienie na okres od trzech do pięciu godzin w celu złożenia jaj, a następnie usunąć osobniki dorosłe. W ten sposób utworzy się mała, rozwojowo zsynchronizowana hodowla od 50 do 150 nicieni; aby doprowadzić nicienie do wczesnej dorosłości, inkubować płytki Petri w temperaturze 20 °C przez cztery do pięciu dni.
W dniu analizy wideo należy użyć jednego mililitra dejonizowanej wody destylowanej do wypłukania płytki z młodymi dorosłymi nicieniami, zbierając w ten sposób od 50 do 150 osobników z zsynchronizowanej hodowli. Należy wykorzystać mikrowirówkę, aby ściągnąć nicienie na dno probówki, lub pozwolić im opaść grawitacyjnie przez około 15 minut. Następnie należy usunąć większość wody z probówki i zastąpić ją jednym mililitrem dejonizowanej wody destylowanej, aby wypłukać przylegające do nicieni bakterie.
Za pomocą mikropipety przenieś od pięciu do 10 nicieni w wodzie do kuwety kwarcowej. Złóż układ optyczny zgodnie z przedstawionym schematem, wykorzystując laser helowo-neonowy o długości fali 543 nanometrów, dwa lustra aluminiowe z odbiciem od powierzchni przedniej do kierowania wiązki lasera przez kuwetę, uchwyt do kuwety, ekran projekcyjny oraz szybką kamerę zdolną do filmowania z prędkością około 240 klatek na sekundę. Następnie użyj kawałka parafiny, aby zakryć górną część kuwety, i odwróć ją, aby wymieszać nicienie w słupie wody.
Umieść vete w uchwycie do vete w taki sposób, aby nicienie znajdowały się początkowo w górnej części vete. Za pomocą luster skieruj wiązkę lasera przez środek vete. Ponieważ nicienie są gęstsze od wody, będą powoli opadać na dno vete, przepływając przez kolumnę wody; na ekranie projekcyjnym zaznacz punkt odpowiadający przechodzącej wiązce lasera kolorem czarnym, aby zmniejszyć rozproszenie w miejscu, w którym wiązka pada na ekran.
Eliminacja lub redukcja rozproszenia wiązki przechodzącej zapobiegnie nasyceniu matrycy CCD kamery przez tę wiązkę. Aby określić rozmiar wzoru dyfrakcyjnego, narysuj linię o długości około pięciu centymetrów na ekranie projekcyjnym obok plamki przechodzącej wiązki laserowej, tak aby nie zasłaniać obrazu światła dyfrakcyjnego. Wyłącz światło w pomieszczeniu i rejestruj obrazy dyfrakcyjne na ekranie w momencie, gdy nicienie przechodzą przez wiązkę lasera.
Aby przygotować dane wideo, zainstaluj następujący program do analizy wideo i zaimportuj do niego nagranie. Używając oprogramowania, ustaw punkt początkowy tak, aby pokrywał się z transmitowaną plamką laserową. Śledź przemieszczenie kątowe obrazu dyfrakcyjnego tworzonego przez każdego nicienia.
Skopiuj i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego, a następnie do wszystkich ujemnych kątów dodaj 180 stopni lub PI, aby uzyskać ciągły wykres. Korzystając z zestawu do analizy wideo, umieść fotodiodę o małej powierzchni poza centrum wzoru dyfrakcyjnego, bezpośrednio przed ekranem projekcyjnym, podłączając ją przez port USB.
Podłącz fotodiodę do oscyloskopu cyfrowego połączonego z komputerem. Obserwuj wzorce drgań na ekranie komputera. Zapisz zestawy danych w formacie ASCII lub tekstowym w celu ich analizy.
Wykorzystaj wideo lub zdjęcie, aby zaimportować dane do programu do analizy danych umożliwiającego dopasowywanie przebiegów falowych. Używając minimalizacji chi-kwadrat, dopasuj krzywą sinusoidalną w celu wyznaczenia częstotliwości miotania. Oblicz średnią częstotliwość pływania dla różnych próbek i wyznacz wariancję.
W niniejszym badaniu dane analizowano statystycznie przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Bonferroniego. Wartość P mniejsza od 0,05 uznano za statystycznie istotną dla wzorców dyfrakcyjnych. Rozpocznij od użycia mikroskopu do wykonania obrazów w celu analizy obrazu.
Przeciągnij plik do programu Mathematica. Użyj polecenia binary eyes, aby przekonwertować go na obraz czarno-biały. Alternatywnie zastosuj polecenie edge detect, aby stworzyć obraz czarno-biały, w którym dwie ostatnie liczby kontrolują stopień rozdzielczości wynikłych krawędzi.
Następnie, korzystając z polecenia image data, przekształć obraz w macierz zer i jedynek. Użyj polecenia forer, aby wykonać transformację macierzy, następnie oblicz kwadrat wartości bezwzględnej macierzy i wyświetl otrzymany obraz, który stanowi wzór dyfrakcyjny odpowiadający obrazowi oryginalnemu. Dodatkowo zastosuj funkcję log, aby przeskalować kontrast obrazu.
Na koniec porównaj modelowe wzory dyfrakcyjne z wzorami dyfrakcyjnymi otrzymanymi od swobodnie pływających nicieni. W niniejszym przykładzie badano *C. elegans* w kwarcowej kasecie Q-vet o szerokości jednego centymetra, grubości pięciu milimetrów i wysokości czterech centymetrów. Pobieranie próbek od pojedynczego nicienia za pomocą analizy wideo.
Średnia częstotliwość pływania uzyskana z analizy wideo w naczyniu o grubości pięciu milimetrów wynosiła około 2,5 hertz. Podobnie, pobranie próbek z jednego nicienia przy użyciu metody akwizycji danych w czasie rzeczywistym i oscyloskopu cyfrowego pozwoliło uzyskać częstotliwość pływania wynoszącą około 2,7 hertz. Procedurę tę można powtórzyć dla wielu nicieni.
Szczegółowe badanie swobodnie pływających nicieni wykazało średnią częstotliwość pływania wynoszącą 2,37 hertz w pięciomilimetrowej probówce. Zgodnie z oczekiwaniami, częstotliwość pływania jest wyższa niż w przypadku pełzającego nicienia. Z zastosowaniem tej metody dyfrakcyjnej ustalono, że średnie częstotliwości pływania C. elegans, ograniczonego do szkiełka mikroskopowego, odpowiadają wcześniej opublikowanej wartości dwóch herców.
Zgodnie z treścią filmu. Przygotowanie danych i modelowanie wzorów dyfrakcyjnych zaprezentowane w tym materiale umożliwiają modelowanie wzorów dyfrakcyjnych podczas pływania. Przy wykorzystaniu obrazów nicieni uzyskanych za pomocą konwencjonalnego mikroskopu, wymodelowane wzory dyfrakcyjne służą do symulacji cyklu pływania *Caenorhabditis elegans*.
Skuteczny model składa się z fizycznie możliwych do zrealizowania wzorców pływania, odpowiadających częstotliwościom pływania. Robak powinien znajdować się w tej samej pozycji na końcu cyklu pływania, w której był na jego początku. Po opanowaniu tej techniki, w przypadku każdego robaka można ją przeprowadzić w mniej niż minutę, korzystając z szybkiej metody fotograficznej i obserwując cykle pływania na ekranie komputera.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat oceny swobodnie pływających nicieni.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowatorskie podejście do analizy zachowania pływackiego nicienia C. elegans z wykorzystaniem wzorów dyfrakcyjnych. Poprzez śledzenie okresowości czasowej tych wzorów badacze mogą uzyskać wgląd w lokomocję tych mikroskopijnych organizmów w środowisku trójwymiarowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Analiza behawioralna
Wstęp
- C. elegans jest organizmem modelowym do badania lokomocji.
- Tradycyjne metody mikroskopowe ograniczają obserwację organizmów w przestrzeni trójwymiarowej.
- Wzory dyfrakcyjne mogą stanowić nową metodę analizy ruchu.
- Technikę tę można zastosować w odniesieniu do innych przezroczystych organizmów mikroskopowych.
Cel badania
- Pomiar częstotliwości ruchów wirowych (thrashing) swobodnie pływających C. elegans.
- Analiza wzorców lokomocji z wykorzystaniem analizy dyfrakcyjnej.
- Udoskonalenie istniejących metod obserwacji zachowania pływackiego.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zsynchronizowanej hodowli C. elegans.
- Konfiguracja układu optycznego z wykorzystaniem lasera helowo-neonowego.
- Rejestracja wzorów dyfrakcyjnych podczas przepływania nicieni przez wiązkę laserową.
- Analiza danych z wykorzystaniem oprogramowania do analizy wideo i metod statystycznych.
Główne wyniki
- Średnia częstotliwość pływania C. elegans została zmierzona na poziomie około 2,37 Hz.
- Zaobserwowano różnice w częstotliwości pływania w porównaniu do zachowania pełzającego.
- Technika ta umożliwia obserwację lokomocji w trzech wymiarach w czasie rzeczywistym.
- Analiza statystyczna potwierdziła istotność wyników.
Wnioski
- Ta metoda dyfrakcyjna stanowi wartościowe narzędzie do badania zachowań pływackich u C. elegans.
- Podejście to można zaadaptować do badania innych organizmów mikroskopijnych.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć analizę wpływu wzorców lokomocji w różnych warunkach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ilościowa analiza wolno pływających mikroorganizmów z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej umożliwia wysokoprzepustowy pomiar lokomocji w czasie rzeczywistym w trzech wymiarach, przełamując ograniczenia tradycyjnej mikroskopii. Podejście to dostarcza rzetelnych, ilościowych wyników dla fenotypowania behawioralnego i walidacji funkcjonalnej we wczesnej fazie odkryć. Metoda ta zwiększa wiarygodność prognostyczną w walidacji celów oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego w procesach badawczych nad neurobiologią i zaburzeniami ruchu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia ilościową analizę funkcji nerwowo-mięśniowej u żywych, nieskrępowanych organizmów modelowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez pomiar w czasie rzeczywistym wyników behawioralnych w zmiennych warunkach.
- Ułatwia mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez rozróżnianie prawidłowych i zaburzonych wzorców lokomocji.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe punkty końcowe do selekcji projektów w portfolio i podejmowania decyzji na wczesnych etapach.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowany, wysokoprzepustowy pomiar aktywności lokomocyjnej do screeningu fenotypowego.
- Generuje powtarzalne, ilościowe dane odpowiednie do opracowywania testów i oceny związków.
- Umożliwia szybkie porównanie wskaźników lokomocji w różnych warunkach eksperymentalnych i dla różnych tła genetycznych.
- Wspiera skalowalność platformy i możliwość jej ponownego wykorzystania dla różnych przezroczystych mikroorganizmów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie fenotypowania behawioralnego do punktów końcowych istotnych dla chorób w obszarze neurobiologii i zaburzeń ruchu.
- Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć po przedkliniczną walidację celów neuromięśniowych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ilościowe, statystycznie zwalidowane wyniki.
- Ułatwia predykcyjne ograniczanie ryzyka w przypadku hipotez terapeutycznych związanych z ruchem.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda dyfrakcji laserowej wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając ilościową analizę behawioralną – od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację wiodących cząsteczek, aż po badania przedkliniczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kwantyfikację funkcji nerwowo-mięśniowej w żywych organizmach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne wskaźniki lokomocji do przesiewania związków chemicznych i genetycznego.
- Analityka: Dostarcza ilościowe pomiary częstotliwości i wyniki statystyczne dla rzetelnego porównywania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z fazą przedkliniczną poprzez dopasowanie wyników behawioralnych do modeli chorób.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje skalowalną, wielokrotnego użytku platformę do różnorodnych badań przejrzystych mikroorganizmów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neuromięśniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i przyspiesza fenotypowanie behawioralne przy wysokiej powtarzalności i wydajności.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych, ilościowych punktów końcowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów terapeutycznych związanych z zaburzeniami ruchu.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu aparatury optycznej i ilościowej analizy behawioralnej.
- Wymaga dostępu do układu dyfrakcji laserowej, obrazowania wysokiej rozdzielczości czasowej oraz infrastruktury do analizy danych.
- Wymaga standaryzacji protokołów akwizycji danych i analizy statystycznej pomiędzy zespołami.
- Możliwość dostosowania do różnych przezroczystych mikroorganizmów po odpowiedniej kalibracji.
- Ograniczenie do organizmów i warunków kompatybilnych z dyfrakcją optyczną i obrazowaniem w czasie rzeczywistym.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
C. elegans Preparation for Video Analysis
2:52
Optical Setup for the Video Analysis
4:36
Video Data Preparation
5:23
Real Time Data Acquistion for Instant Observation of Swimming Frequencies and Data Analysis
6:36
Model Diffraction Patterns Using Mathematica as an Example
7:48
Representative Laser Diffraction Results
9:34
Conclusion
