Roztwór strukturalny białka fluorescencyjnego Cerulean za pomocą MeshAndCollect

Zautomatyzowany protokół MeshAndCollect został opracowany w celu połączenia krystalografii szeregowej ze standardowym gromadzeniem danych o rotacji w celu pomiaru małych kryształów z próbek krążków. Metoda najpierw identyfikuje położenie kryształów zamontowanych na tym samym uchwycie próbki, aby następnie skierować zbieranie częściowego zestawu danych, który zostanie następnie połączony i wykorzystany do rozwiązania struktury. MeshAndCollect jest przekonujący, ponieważ pozwala na szybkie przeprowadzanie eksperymentów przy użyciu tej samej konfiguracji, roztworu struktury, badań przesiewowych ligandów, a wszystko to z małymi kryształami.

Metoda jest kompatybilna z VMX linii synchrotronowej, idealnie wyposażonej w wysoką elastyczność fotonów, małą średnicę wiązki i detektor szybkiego przeładowania. W pierwszej kolejności należy połączyć się z rozszerzoną bazą danych systemu informatycznego krystalografii białek i wybrać MX.Zaloguj się za pomocą numeru eksperymentu i hasła z formularza A. Następnie wybierz opcję Dodaj nową przesyłkę i wprowadź wymagane informacje.

Wybierz opcję Dodaj częściową i wypełnij odpowiednie dane. Wybierz opcję Dodaj kontener, wybierz krążek SC3 i wypełnij wymagane informacje, w tym pozycje posiadaczy próbek w krążku. W klatce doświadczalnej załaduj krążek do zmieniarki próbek i zanotuj jego położenie.

Następnie zaloguj się do systemu informatycznego dla bazy danych linii krystalografii białek. Wybierz opcję Przygotuj eksperyment, znajdź przesyłkę, wybierz pozycję Dalej, a następnie wskaż linię badawczą i pozycję krążka w zmieniaczu próbek. Zaloguj się do oprogramowania sterującego linią za pomocą numeru eksperymentu i hasła podanych na formularzu A.

Naciśnij przycisk Sync, aby zsynchronizować oprogramowanie sterujące linią badawczą z systemem informacyjnym bazy danych linii krystalografii białek. Za pomocą oprogramowania sterującego linią badawczą zamontuj uchwyt próbki na goniometrze. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję w obszarze zmieniacza próbek i wybierz opcję Zamontuj próbkę.

Wybierz środkowy przycisk, a następnie trzy kliknięcia wyśrodkuj środek na środku krawędzi końcówki pętli. Zapisz pozycję wyśrodkowaną, wybierając opcję Zapisz. W obszarze Zaawansowane dodaj przepływ pracy Reorientacja wizualna do kolejki zbierania danych.

Następnie uruchom przepływ pracy, klikając Collect Queue. Następnie wybierz jedną z zapisanych pozycji środkowych, klikając na nią. Kliknij ponownie środkowy przycisk, a następnie trzykrotne kliknięcie środka na środku początku trzonu pętli.

Zapisz drugą pozycję, klikając Zapisz. A następnie kliknij Kontynuuj. Po tym, jak przepływ pracy wyrówna płaszczyznę uchwytu próbki z osią obrotu goniometru, ponownie wyśrodkuj uchwyt próbki gdzieś w środku siatki.

Ustawić uchwyt próbki tak, aby powierzchnia siatki była prostopadła do kierunku wiązki promieniowania rentgenowskiego, obracając oś omega za pomocą oprogramowania sterującego linią promieniowania. W oprogramowaniu sterującym linią badawczą należy kliknąć w menu rozwijane Przysłona i wybrać wartość. Następnie kliknij ikonę narzędzia siatki, aby wyświetlić okno narzędzia siatki.

W widoku próbki w oprogramowaniu sterującym linią badawczą narysuj siatkę klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając myszką nad obszarem zawierającym kryształy na uchwycie próbki. Aby zapisać siatkę, kliknij przycisk plusa w oknie narzędzia siatki. W polu rozdzielczości oprogramowania sterującego linią należy wpisać rozdzielczość, w jakiej mają być zbierane obrazy dyfrakcyjne.

Jeśli nie są znane żadne wcześniejsze informacje na temat jakości dyfrakcyjnej kryształów, zalecana jest wartość od dwóch do 2,5. Wybierz pozycję MeshAndCollect na karcie Zaawansowane zbieranie danych. Dodaj go do kolejki i kliknij przycisk Zbierz kolejkę.

W oknie parametrów należy użyć domyślnych parametrów zależnych od linii badawczej. W opisanym tutaj eksperymencie domyślne parametry to czas ekspozycji 0,037 sekundy na punkt skanowania siatki, 100% transmisja i oscylacja jednego stopnia na linię skanowania siatki. Kliknij Dalej.

Skanowanie siatki przebiega, a obrazy dyfrakcyjne zebrane w każdym punkcie siatki są analizowane i klasyfikowane według siły dyfrakcji za pomocą oprogramowania Dopycharka. Po analizie spycharki generowana jest mapa cieplna, a kolejność kolejnych częściowych zbiorów danych jest przypisywana automatycznie na podstawie siły dyfrakcji. Na koniec kliknij przycisk Kontynuuj, aby uruchomić częściowe zbieranie danych.

MeshAndCollect zaimplementowany w MXCuBE został wykorzystany do zbierania częściowych zestawów danych dyfrakcyjnych z małych kryształów Cerulean znajdujących się na tym samym uchwycie próbki, w którym identyfikacja wizualna kryształów była trudna. Aby przesiać uchwyt próbki, narysowano siatkę nad środkiem pętli siatki i na podstawie mapy cieplnej punktacji spycharki automatycznie zebrano 85 zestawów danych dyfrakcji częściowej. Zostały one indywidualnie zintegrowane, a następnie połączone w celu uzyskania zestawu danych o kompletności 99,8% przy rozdzielczości 1,7 angstremów.

Zgodnie z oczekiwaniami, struktura krystaliczna Cerulean może zostać rozwiązana przez zastąpienie molekularne przy użyciu wygenerowanego zestawu danych. Po udoskonaleniu uzyskano pracę R na poziomie 22,8% i wolną od R na poziomie 25,4%. Super pozycja wcześniej wyznaczonej struktury pokazuje globalny RMSD na pozycjach c-alfa wynoszący 0,1 angstrema.

Dla projektów, w których następuje optymalizacja fazy wzrostu kryształów, MeshAndCollect zapewnia możliwość uzyskania kompletnego zestawu danych w oparciu o kombinację tych amorficznych częściowych zestawów danych uzyskanych z mniejszych kryształów. Technika ta utorowała drogę biologom strukturalnym do rozwiązania struktury z próbki części, z której nie można było wytworzyć tylko kilku dziesiątych mikrokryształów.