Wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej G-Quadruplex
6 października 2022
Obecny protokół demonstruje użycie szybkiego, 3-stopniowego, opartego na aptamie testu wykładniczego amplifikacji do wykrywania celów. Przygotowanie próbki, wzmocnienie sygnału i rozwój koloru są omówione w celu wdrożenia tego systemu do rozpoznawania obecności teofiliny w porównaniu z kofeiną.
Metoda ta oferuje sposób na wzmocnienie sygnału ze zdarzeń wiązania do postaci, która jest wykrywalna wizualnie przy niskim zużyciu zasobów lub może być określona ilościowo za pomocą oprzyrządowania opartego na absorbancji. Jest to stosunkowo szybki, jednoetapowy protokół do określenia obecności celu aptamera w próbce będącej przedmiotem zainteresowania. Wyniki można porównać ze standardową krzywą kalibracyjną, jeśli pożądane jest określenie ilościowe.
Osoby muszą być bardzo precyzyjne podczas przenoszenia i mieszania roztworów, ponieważ niewystarczające wymieszanie doprowadzi do negatywnych wyników. Upewnij się również, że odczynniki i roztwory są przechowywane w chłodzie do czasu użycia, aby zminimalizować sygnał tła. Rozpocznij od aktywacji produktów rozszczepienia rybozymu poprzez dodanie pięciu jednostek kinazy polinukleotydowej T4 w probówce PCR.
Następnie dodaj jeden mikrolitr wstępnie przygotowanego buforu rybozymu 5X do każdej probówki z próbką. Aby wizualnie zademonstrować specyficzność, dodaj 1,5 mikrolitra dwumilimolowej teofiliny lub dwóch milimolowych kofein do każdej probówki jako próbki testowe i dokładnie wymieszaj każdą próbkę, pipetując od pięciu do 10 razy. Następnie dodaj dwa mikrolitry 600 nanomolowego RNA zawierającego specyficzną dla celu domenę aptameryczną do każdej probówki z próbką, a następnie pipetuj w celu szybkiego wymieszania składników.
Teraz umieść rurkę na zimnym bloku, aby zminimalizować sygnał tła. Po przygotowaniu wszystkich probówek reakcyjnych inkubować każdą próbkę w temperaturze pokojowej dokładnie przez trzy minuty. Pod koniec inkubacji należy natychmiast umieścić probówki z próbkami w lodzie.
Dodaj 3,5 mikrolitra mieszaniny enzymów polimerazy kazazy do każdej probówki z próbką i dobrze wymieszaj. Następnie dodać 31,5 mikrolitra mieszaniny reakcyjnej EXPAR zawierającej nukleotydy matrycowe i bufor reakcyjny do każdej probówki z próbką i wymieszać pipetując. Po przygotowaniu wszystkich próbek należy inkubować przygotowaną próbkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez pięć minut za pomocą timera.
Po inkubacji natychmiast umieścić probówki z próbkami w lodzie. Dodaj dwa mikrolitry roztworu heminy do każdej probówki z próbką w celu opracowania koloru i dobrze wymieszaj. Następnie dodaj 58 mikrolitrów dostępnego w handlu roztworu TMB do każdej probówki z próbką, dobrze wymieszaj i inkubuj w celu uzyskania koloru.
Odczytać próbki jakościowo na oko lub określić ilościowo wyniki za pomocą czytnika płytek absorbancyjnych, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Zoptymalizowany konstrukt jest w stanie rozpoznać zaledwie 500 nanomolowych teofilin w ciągu 30 minut. Preparaty próbek wystawione na działanie celu mają niebieski kolor, podczas gdy próbki niezawierające celu pozostają bezbarwne.
Krzywa wzorcowa została przygotowana na podstawie sygnału zmierzonego w A450 po 30 minutach wywoływania koloru. Ważne jest, aby trzymać próbki na lodzie, gdy nie przeprowadza się inkubacji, ponieważ nawet zoptymalizowane RNA nadal będzie wykazywać niski poziom aktywności tła.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia szybki, trzyetapowy test wykrywania teofiliny i podobnych celów, oparty na wykładniczej amplifikacji z wykorzystaniem aptamerów. Obejmuje on przygotowanie próbek, amplifikację sygnału oraz rozwój barwy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Chemia analityczna
- Biotechnologia
Wstęp
- Aptamery to krótkie, jednoniciowe cząsteczki RNA lub DNA, które mogą wiązać się ze specyficznymi celami.
- Wzmocnienie sygnału jest kluczowe dla wykrywania celów o niskiej liczebności.
- Metody detekcji wizualnej mogą być korzystne w warunkach ograniczonych zasobów.
- Precyzyjne obchodzenie się z odczynnikami jest niezbędne dla uzyskania dokładnych wyników.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej metody wykrywania teofiliny w obecności kofeiny.
- Przedstawienie protokołu jednopojemnikowego (one-pot) dla wzmocnienia sygnału.
- Umożliwienie ilościowego oznaczenia wyników przy użyciu krzywej kalibracyjnej.
Zastosowane metody
- Aktywacja produktów cięcia rybozymu za pomocą polinukleotydowej kinazy T4.
- Wizualna detekcja zdarzeń wiązania.
- Kwantyfikacja z wykorzystaniem aparatury opartej na pomiarze absorbancji.
- Staranne mieszanie i chłodzenie odczynników w celu zminimalizowania sygnału tła.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia wykrywanie teofiliny w próbkach.
- Wyniki mogą być interpretowane wizualnie lub ilościowo.
- Precyzja w przygotowywaniu roztworów jest kluczowa dla uzyskania pomyślnych rezultatów.
- Sygnały tła można zminimalizować poprzez właściwe zarządzanie odczynnikami.
Wnioski
- Analiza oparta na aptamerach jest szybką i skuteczną metodą detekcji celu.
- Może ona zostać dostosowana do różnych zastosowań w środowiskach o ograniczonych zasobach.
- Przyszłe badania mogą objąć eksplorację dodatkowych celów oraz optymalizację protokołu.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Systemy detekcji oparte na aptamerach z izotermiczną amplifikacją wykładniczą oferują szybkie, czułe i wizualnie interpretowalne wyniki w procesie walidacji celu w początkowych etapach odkrywania leków. Ten trzystopniowy protokół amplifikacji G-kwadrupleksów umożliwia odczyty zarówno jakościowe, jak i ilościowe, wspierając podejmowanie trafnych decyzji w kluczowych momentach opracowywania i screeningu testów. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wiązania celu i specyficzności, co bezpośrednio wpływa na selekcję projektów w portfolio oraz przygotowanie dalszych analiz.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę zdarzeń rozpoznawania molekularnego z wykorzystaniem specyficzności aptamerów.
- Wspiera funkcjonalną walidację wiązania celu poprzez wizualnie wykrywalne wyniki.
- Ułatwia szybką ocenę oddziaływania z celem w celu ograniczenia ryzyka mechanistycznego.
- Zwiększa pewność co do selektywności celu poprzez rozróżnianie blisko spokrewnionych analitów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia standaryzowany protokół jednopotowy dla powtarzalnego ustawienia analizy.
- Dostarcza ilościowe wyniki za pomocą pomiaru absorbancji w celu niezawodnej oceny związków.
- Umożliwia szybki screening próbek przy minimalnych wymaganiach sprzętowych.
- Wspiera kwantyfikację opartą na krzywej kalibracyjnej w celu standaryzacji analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Oferuje potencjał adaptacji do biomarkerów istotnych dla przebiegu choroby, przy wsparciu odpowiednim projektem aptameru.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki skalowalnym formatom detekcji.
- Zmniejsza ryzyko wyników fałszywie dodatnich poprzez minimalizację sygnału tła dzięki zoptymalizowanym protokołom.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten system aptamer-EXPAR wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do identyfikacji wiodących związków, stanowiąc pomost między rozpoznawaniem molekularnym a opracowywaniem analiz ilościowych.
- Biologia odkryć: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez potwierdzenie obecności i specyficzności celu.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki odpowiednie dla wysokoprzepustowych badań lub warunków o ograniczonych zasobach.
- Analityka: Umożliwia pomiary oparte na absorbancji oraz generowanie krzywych wzorcowych do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Może zostać dostosowany do detekcji biomarkerów, pod warunkiem ustalenia specyficzności aptameru.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Modułowość protokołu pozwala na adaptację do nowych celów poprzez substytucję domen aptamerowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływy pracy dzięki szybkiemu, zestandaryzowanemu i skalowalnemu protokołowi.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywne kosztowo opracowanie testów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczanie solidnych, ilościowych danych detekcyjnych.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu aptamerów oraz pracy z kwasami nukeinowymi.
- Wymagany jest dostęp do podstawowej aparatury biologii molekularnej oraz czytników płytek absorbancyjnych do kwantyfikacji.
- Wymagane jest precyzyjne dozowanie odczynników i kontrola temperatury w celu zminimalizowania sygnału tła.
- Protokół może zostać dostosowany do różnych celów poprzez modyfikację domeny aptamerowej.
- Niezbędna jest staranna optymalizacja, aby zapewnić specyficzność i zminimalizować liczbę wyników fałszywie dodatnich.
