Metody elektroporacji i potwierdzania przemian u Limosilactobacillus reuteri DSM20016
23 czerwca 2023
Tutaj prezentujemy protokoły pracy z DSM20016 Limosilactobacillus reuteri, szczegółowo opisując wzrost, transformację plazmidu, PCR kolonii, pomiar fluorescencyjnego białka reporterowego i ograniczone mini-przygotowanie plazmidu, a także typowe problemy i rozwiązywanie problemów. Protokoły te umożliwiają pomiar białek reporterowych w DSM20016 lub potwierdzenie za pomocą PCR kolonii, jeśli nie jest zaangażowany reporter.
L.Reuteri, a w szczególności szczep, DSM20016 jest solidnym, naturalnym komensalem jelitowym człowieka, z wielką nadzieją na dostarczanie terapeutyczne i wykrywanie chorób w całym przewodzie pokarmowym. Prace te pomogą pozycjonować DSM20016 jako podwozie biologii syntetycznej do tego rodzaju zastosowań. Pałeczki kwasu mlekowego nie mają specyficznego organizmu modelowego.
Istnieją preferowane gatunki, ale zwykle są one wybierane z uprzedzeniami do określonych celów badawczych. Zmienność w obrębie rodziny bakterii doprowadziła do fragmentarycznych protokołów, z których niektóre z iteracjami modyfikacji sięgają wstecz w publikacjach. Osobom rozpoczynającym naukę bardzo trudno jest dokładnie przefiltrować, co jest, a co nie jest przydatne.
Istnieje jedna praca na temat transformacji DSM20016, ale nie jest ona nowoczesna. Istnieją nowoczesne protokoły dla innych członków rodziny Lactobacillales, ale nie są one DSM20016. Tutaj staramy się zapewnić łatwy w użyciu, scentralizowany, zmodernizowany, kompletny zestaw protokołów do DSM20016 elektroporacji.
Ten zestaw protokołów oferuje znaczną modernizację w stosunku do poprzedniego protokołu eksploracji DSM20016 i wyjaśnia niektóre wiszące wątki, a także podkreśla części, które wcześniej były mniej jasne. Zestaw protokołów jest również kompletny, a konkretnie dla DSM20016, szczepu, dla którego inne protokoły inne niż DSM20016 nie są w pełni kompatybilne. Jednym z naszych głównych celów jest wykorzystanie mikroorganizmów jako niedrogich czujników i systemów dostarczania.
Współpracujemy z ekspertami w dziedzinie chorób jelit, aby wykorzystać DSM20016 do wyczucia warunków w przewodzie pokarmowym i dostarczenia leków zgodnie z wymaganiami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokoły pracy z Limosilactobacillus reuteri DSM20016, wytrzymałym komensalem ludzkiego jelita. Protokoły obejmują hodowlę, transformację plazmidową, kolonialną reakcję PCR oraz pomiar fluorescencyjnego białka reporterowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia syntetyczna
- Zdrowie przewodu pokarmowego
Wstęp
- Limosilactobacillus reuteri DSM20016 jest naturalnym komensalem jelitowym człowieka.
- Szczep ten wykazuje potencjał w zakresie dostarczania terapeutyków oraz wykrywania chorób.
- Protokoły w tym obszarze są często fragmentaryczne i trudne do opracowania.
- Cele badawcze mogą wpływać na wybór gatunków bakteryjnych.
Cel badania
- Dostarczenie jasnych protokołów pracy z DSM20016.
- Ułatwienie pomiaru białek reporterowych oraz potwierdzenia za pomocą kolonialnej reakcji PCR.
- Omówienie powszechnych problemów i rozwiązań w ramach protokołów.
Zastosowane Metody
- Wzrost Limosilactobacillus reuteri DSM20016.
- Techniki transformacji plazmidowej.
- Kolonijna PCR w celu potwierdzenia modyfikacji genetycznych.
- Pomiar białek reporterowych fluorescencyjnych.
Główne wyniki
- Opracowano skuteczne protokoły hodowli i transformacji.
- Metoda Colony PCR potwierdziła obecność pożądanych konstruktów genetycznych.
- Skutecznie zmierzono poziomy fluorescencyjnych białek reporterowych.
- Przedstawiono wytyczne rozwiązywania problemów dla najczęstszych trudności.
Wnioski
- Protokoły te zwiększają użyteczność szczepu DSM20016 w badaniach.
- Stanowią one podstawę dla przyszłych zastosowań w biologii syntetycznej.
- Jasne wytyczne pomagają badaczom w analizie rozproszonej literatury.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zcentralizowane, specyficzne dla szczepu protokoły elektroporacji i potwierdzania transformacji dla Limosilactobacillus reuteri DSM20016 wypełniają krytyczną lukę w rozwoju chassis biologii syntetycznej do zastosowań celowanych w jelita. Standaryzowane przepływy pracy redukują niejednoznaczność i umożliwiają reprodukowalne modyfikowanie drobnoustrojów komensalnych w celu dostarczania terapeutyków oraz wykrywania chorób. Pozycjonuje to szczep DSM20016 jako niezawodną platformę dla wczesnych etapów badań i rozwoju w biofarmanaceutyce ukierunkowanej na zdrowie przewodu pokarmowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia skuteczną manipulację genetyczną szczepu DSM20016 w celu funkcjonalnej analizy celów.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wyjaśnienie wykonalności transformacji w kluczowym szczepie komensalnym.
- Ułatwia przewidywalną pewność w wyborze szczepów dla rurociągów biologii syntetycznej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane protokoły przygotowania szczepu DSM20016 jako chassis gotowego do screeningu.
- Standaryzuje transformację i pomiar reportera w celu uzyskania powtarzalnych wyników analizy.
- Umożliwia wiarygodną ocenę zmodyfikowanych konstruktów w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje zmodyfikowany szczep DSM20016 do celów translacyjnych w zakresie celowanego dostarczania terapeutyków do jelit.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w modelach przewodu pokarmowego.
- Zmniejsza ryzyko związane z przejściem z modyfikowanymi bakteriami komensalnymi do badań translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejsze protokoły integrują etap wczesnego odkrycia z opracowywaniem testów, umożliwiając usprawniony proces przejścia od inżynierii genetycznej do przesiewania funkcjonalnego w szczepie DSM20016.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i inżynierię szlaków w organizmie gospodarza komensalnego.
- Screening: Zapewnia powtarzalną transformację i ilościowe odczyty z reporterów dla dalszych etapów procesów badawczych.
- Analityka: Umożliwia pomiar wydajności transformacji i ekspresji reporterów w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Stanowi podstawę do oceny przedklinicznej zmodyfikowanych szczepów w kontekście istotnym dla jelit.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Ustanawia szczep DSM20016 jako reużywalną, zestandaryzowaną platformę dla badań i rozwoju w dziedzinie biologii syntetycznej.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w inżynierii komensali서.
- Wartość operacyjna: Dostarcza standaryzowanych, powtarzalnych i skalowalnych protokołów manipulacji szczepami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową w programach dotyczących mikrobiomu jelitowego we wczesnej fazie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację zmodyfikowanych terapeutyków mikrobiologicznych z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu genetyki mikrobów oraz technik elektroporacji.
- Wymagany jest dostęp do sprzętu do elektroporacji oraz czytnika płytek.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu przyjęcia protokołu i rozwiązywania problemów.
- Ze względu na zmienność genotypową może być wymagana adaptacja dla innych szczepów Lactobacillales.
- Kompatybilność protokołu jest specyficzna dla szczepu DSM20016 i może nie być możliwa do zastosowania w innych szczepach.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:04
Preparing Limosilactobacillus reuteri DSM20016 Electrocompetent Cells for Electroporation
5:27
Measurement of the Acid‐Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2
7:03
Confirmation of Plasmid Uptake via Colony PCR
8:45
Mini‐Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR
