Oznaczanie aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyka zewnątrzkomórkowego (EV) za pomocą czasu krzepnięcia aktywowanego przez EV (EV-ACT)
4 sierpnia 2023
Ten protokół bada użycie osocza bogatego w pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) jako wskaźnika zdolności krzepnięcia EV. Osocze bogate w EV uzyskuje się w procesie wirowania różnicowego, a następnie ponownego zwapnienia.
Skupiamy się przede wszystkim na zaburzeniach krzepnięcia u pacjentów, którzy doznali urazu mózgu. W tym badaniu staramy się monitorować zmiany w funkcji krzepnięcia za pomocą czasu krzepnięcia aktywności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Nasze zespoły zwróciły uwagę na badania nad uszkodzeniem mózgu, a w urazie mózgu występują ciężkie stany, które nazywamy stanem hiperkoagulacji, jest to bardzo trudne do zmierzenia, a we krwi pacjenta znajdują się mikropęcherzyki, które nazywamy pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, w tym ciało apoptozy, mikropęcherzyki i egzosom.
Różnią się one zdolnością do prokoagulacji, więc musimy znaleźć metodę pomiaru tej zdolności. I ta metoda możemy szybko wyostrzyć, aby znaleźć różnicę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. To bardzo ważne.
W zależności od tej miary możemy zrobić wiele rzeczy. Mamy pewność, że u myszy TPI i pacjenta klinicznego, zwłaszcza w krążeniu obwodowym, będzie to kosztować pewną embolizację, która jest bardzo, bardzo poważna w warunkach klinicznych. Nasz protokół oferował znaczną przewagę w porównaniu z innymi technikami ze względu na swoją prostotę, opłacalność i szybkość.
Pozwala na przeprowadzenie badania krzepliwości krwi przy łóżku pacjenta, eliminując potrzebę intensywnego przetwarzania laboratoryjnego. Nasze badania opracowały nową metodę, która może mierzyć stany hiperkoagulacji krwi obwodowej. Może być stosowany nie tylko w TPI, możemy również stosować w innych chorobach, takich jak suplazja przedrzucawkowa, choroba nowotworowa i hematologiczna.
W przyszłości planowaliśmy zbadać zoo EV ACT w skanowaniu pod kątem klinicznej nadkrzepliwości, stanu, który zwiększa ryzyko zakrzepów krwi. Aby rozpocząć odwirowywanie ludzkiej krwi o stężeniu 120 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia krwinek, należy następnie przenieść górną połowę supernatantu do nowej probówki. Następnie odwirować osocze bogatopłytkowe w celu usunięcia płytek krwi i przenieść górną połowę supernatantu do nowej probówki.
Następnie usuń resztki komórek, odwirowując osocze ubogie w płytki krwi w temperaturze 13 000 G przez dwie minuty. Przenieś górną połowę supernatantu do nowej probówki, włącz analizator skrzepów, aby wykryć pęcherzyk zewnątrzkomórkowy lub czas krzepnięcia aktywowany przez EV i podgrzej instrument do 37 stopni Celsjusza. Zainstaluj jednorazową sondę i kubek testowy, a następnie rozpocznij procedurę kontroli jakości maszyny.
Po przeprowadzeniu kontroli jakości wprowadź informacje o próbce do systemu. Następnie dodaj 200 mikrolitrów osocza bogatego w EV do kubka testowego, a następnie 20 milimolowych, 170 mikrolitrów chlorku wapnia. Kliknij przycisk start, zamknij pokrywę i pozwól sondzie wykryć zmianę rezystancji próbki.
Niekwalifikowane próbki EV wykazują wyraźny klaster z nieco większym rozmiarem cząstek w pobliżu bramki EV.In przeciwieństwie do tego, kwalifikowane próbki bogate w EV wykazały większość sygnałów w bramce EV jako pojedyncza grupa. Wzrost stężenia EV, skrócenie czasu krzepnięcia aktywowanego EV, przy jednoczesnym spadku stężenia EV, wydłużenie czasu krzepnięcia aktywowanego EV. Próbki osocza bogatego w EV od pacjentów ze stanem przedrzucawkowym, złamaniami szyjki kości udowej i rakiem płuc miały znacznie krótszy czas krzepnięcia aktywowanego EV w porównaniu ze zdrowymi ochotnikami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza analiza bada zaburzenia krzepnięcia u pacjentów z urazami mózgu poprzez monitorowanie funkcji krzepnięcia za pomocą aktywności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV). Badania koncentrują się na stanie nadkrzepliwości, który jest trudny do zmierzenia, i mają na celu opracowanie metody oceny zdolności prokoagulacyjnych EV w próbkach krwi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Zaburzenia krzepnięcia
- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe
Wstęp
- Zaburzenia krzepnięcia są powszechne u pacjentów z urazami mózgu.
- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) odgrywają istotną rolę w procesach krzepnięcia.
- Pomiar stanu hiperkoagulacji jest złożony.
- Różne typy EVs wykazują zróżnicowane zdolności prokoagulacyjne.
Cel badania
- Monitorowanie zmian w funkcji krzepnięcia związanych z aktywnością EV.
- Opracowanie metody pomiaru zdolności krzepnięcia EV.
- Pogłębienie zrozumienia procesów krzepnięcia w przypadkach urazów mózgu.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie osocza bogatego w EV za pomocą wirowania różnicowego.
- Rekalcyfikacja próbek osocza do analizy.
- Ocena funkcji krzepnięcia z wykorzystaniem aktywności EV.
- Monitorowanie mikropęcherzyków, w tym ciał apoptotycznych i egzosomów.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano różnice w zdolnościach prokoagulacyjnych różnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs).
- Opracowano szybką metodę oceny stanu krzepnięcia.
- Wykazano znaczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) w rozumieniu zaburzeń krzepnięcia.
- Przedstawiono wnioski dotyczące zależności między urazem mózgu a krzepnięciem.
Wnioski
- Badanie oferuje nowe podejście do pomiaru krzepnięcia u pacjentów z urazami mózgu.
- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są kluczowymi wskaźnikami zdolności krzepnięcia.
- Konieczne są dalsze badania w celu sprawdzenia klinicznych implikacji tych wyników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określenie aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) pozwala na wypełnienie krytycznej luki w wczesnym wykrywaniu i ocenie ryzyka stanów hiperkoagulacyjnych w różnych kontekstach chorobowych. Test czasu krzepnięcia aktywowanego pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EV-ACT) umożliwia szybką ocenę krzepnięcia indukowanego przez EVs bezpośrednio przy łóżku pacjenta, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka i walidację celów w badaniach translacyjnych. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w kluczowych punktach zwrotnych w procesie odkrywania leków oraz w fazie badań przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie ścieżek krzepnięcia pośredniczonych przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), istotnych dla mechanizmów chorobowych.
- Wspiera biologiczną ocenę ryzyka poprzez ilościowe określanie funkcjonalnej aktywności prokoagulacyjnej EV.
- Ułatwia walidację celu dla interwencji modulujących uwalnianie lub aktywność EV.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowany, ilościowy test do oceny funkcji prokoagulacyjnej EV w próbkach osocza.
- Dostarcza powtarzalne pomiary wiskoelastyczności w czasie rzeczywistym, odpowiednie do optymalizacji testu.
- Umożliwia szybki przesiew próbek z różnych modeli chorobowych w kierunku ryzyka nadkrzepliwości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób poprzez wykrywanie nadkrzepliwości wywołanej przez EV w próbkach pochodzących z preeklampsji, urazów oraz nowotworów.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych do przedklinicznej walidacji biomarkerów krzepnięcia.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju kandydatów na leki celowane w szlaki EV w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Test EV-ACT integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając funkcjonalną ocenę EV zarówno w stanach zdrowotnych, jak i chorobowych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie aktywności prokoagulacyjnej zależnej od EV w celu wyjaśnienia hipotez mechanistycznych.
- Przesiewanie: Zapewnia szybki, powtarzalny odczyt służący do oceny nadkrzepliwości próbek.
- Analityka: Generuje ilościowe wyniki czasu krzepnięcia do porównań między różnymi warunkami i analiz statystycznych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z modelami przedklinicznymi za pomocą pomiarów EV istotnych dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, zestandaryzowaną platformę do prowadzenia ciągłych funkcjonalnych badań nad EV w różnych wskazaniach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie mechanizmów krzepnięcia związanych z EV oraz walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia możliwość szybkiego, zestandaryzowanego i powtarzalnego testowania przy łóżku pacjenta.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez dostarczenie przydatnych danych o ryzyku krzepnięcia na wczesnym etapie rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów ukierunkowanych na patologie pośredniczące w EV z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu biologii krzepnięcia oraz technik izolacji EV.
- Niezbędny jest dostęp do analizatorów wiskoelastyczności oraz standaryzowanych protokołów przygotowania osocza.
- Wymagana jest koordynacja międzyzespołowa w zakresie parametrów analizy i standardów interpretacji danych.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych modeli chorobowych lub typów próbek.
- Uzyskanie wiarygodnych wyników zależy od jakości procedur wzbogacania i usuwania EV.
