Alternatywne metody wykrywania wytwarzania anionów ponadtlenkowych w płytkach krwi

Zakres naszych badań polega na zrozumieniu, w jaki sposób wytwarzanie reaktywnych form tlenu reguluje funkcję płytek krwi i moduluje odpowiedź hemostatyczną. W naszej pracy niezbędne jest niezawodne wykrywanie kluczowej reaktywnej formy tlenu, anionu ponadtlenkowego. Najczęstszą techniką wykrywania anionów ponadtlenkowych jest cytometria przepływowa z DCFDA jako sondą fluorescencyjną.

Ma to swoje ograniczenia. Indukuje uwalnianie reaktywnych form tlenu, co prowadzi do niewiarygodnych danych, nie pozwala na rozróżnienie różnych reaktywnych form tlenu i nie pozwala na ilościowe określenie form tlenu reaktywnego z płytek krwi. W tym filmie przedstawiono dwie alternatywne techniki wykrywania płytek krwi nad anionami ponadtlenkowymi.

Pierwsza technika wykorzystuje DHE na żywych płytkach krwi do wykrywania anionów ponadtlenkowych z szybką kinetyką i rozdzielczością pojedynczej komórki. Druga technika wykorzystuje sondę spinową CMH do ilościowego określenia szybkości wytwarzania anionów ponadtlenkowych przez płytki krwi. Ogólnie rzecz biorąc, techniki przedstawione w tym filmie oferują znaczące zalety w porównaniu z większością istniejących technik i stanowią znaczący postęp w narzędziach eksperymentalnych, którymi dysponujemy, aby badać regulację płytek krwi zależną od redoks.

Na początek należy przygotować odpowiedni roztwór powlekający w zmodyfikowanym buforze Tyrode'a i pokryć 8-dołkowy mikroszkiełko, inkubując je przez 2 godziny w temperaturze 37 C. Następnie dwukrotnie przemyj powlekane mikroszkiełko zmodyfikowanym buforem Tyrode. Inkubować mikroszkiełko w zmodyfikowanym buforze Tyrode'a zawierającym 5 mg na ml masy ciała przez co najmniej 30 minut w celu wygaszenia niespecyficznej adhezji. Aby przygotować umyte płytki krwi, odwirować krew pełną z antykoagulacją cytrynianu w stężeniu 200 G przez 20 minut, aby uzyskać osocze bogatopłytkowe.

Następnie dodać indometacynę i PGE1 do osocza bogatopłytkowego i odwirować w stężeniu 500 G przez 10 minut. Zawiesić otrzymaną osadkę płytek krwi w zmodyfikowanym buforze HEPES Tyrode'a w temperaturze 37 °C, aby uzyskać gęstość 4 x 10 do mocy 7 płytek krwi na ml. Pozostawić wyizolowane płytki krwi na odpoczynek przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie dodać roztwór DHE do zawiesiny płytek krwi, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 M i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 minutę.

Po inkubacji należy usunąć roztwór blokujący z mikroszkiełka i umieścić go na stoliku mikroskopu w celu obrazowania. Następnie delikatnie dozuj płytki krwi. Użyj 40-krotnej soczewki zanurzeniowej w oleju na odwróconym mikroskopie konfokalnym, aby monitorować konwersję DHE do 2-hydroksyyetidu.

Obraz przez 10 minut, zbierając obrazy co 10 sekund. Aby monitorować wytwarzanie anionów ponadtlenkowych w odpowiedzi na agonistę, dodaj rozpuszczalnego agonistę 10 minut po dozowaniu płytek krwi i zbieraj obrazy fluorescencyjne przez dodatkowe 10 minut. Za pomocą tego protokołu badano wytwarzanie rodników ponadtlenkowych podczas adhezji płytek krwi do kolagenu lub fibrynogenu oraz z płytek krwi przylegających do PLL stymulowanych trombiną.

Na początek należy uzyskać osocze bogatopłytkowe, odwirowując krew pełną z antykoagulacją cytrynianową w stężeniu 200 G przez 20 minut. Dodać indometacynę i PGE1 do osocza i odwirować w stężeniu 500 G przez 10 minut. Powstałą w ten sposób osadówkę płytek krwi zawiesić w zmodyfikowanym buforze HEPES Tyrode w temperaturze 37 °C, aby uzyskać gęstość 2 x 10 do mocy 8 płytek krwi na ml.

Odpocząć płytki krwi przez 30 minut w temperaturze 37 C. Dodać DETC do końcowego stężenia 5 M i deferoksaminę do końcowego stężenia 25 M do zawiesiny płytek krwi, a następnie CMH do końcowego stężenia 200 M. Umieścić próbki w kuwetach agregacyjnych wyposażonych w magnesy mieszające pokryte teflonem i załadować je do agresjometru. Po 1 minucie dodaj bodźce, takie jak trombina lub kolagen i inkubuj przez 10 minut. Po inkubacji przenieść zawiesinę płytek krwi z kuwety agregacyjnej do probówki mikrowirówki i szybko wirować w dół do 6 000 G przez 10 sekund.

Załadować 50 l supernatantu do mikropipet kapilarnych i uszczelnić woskiem uszczelniającym EPR. Przenieś próbki do skanera EPR i ustaw parametry na skanerze. Oszacuj utlenianie CMH do rodnika CM jako obszar pod krzywą zarejestrowanych pików EPR.

Uzyskać krzywą kalibracyjną przy użyciu dostępnego na rynku rodnika CM. Natężenie sygnału EPR w próbkach było proporcjonalne do intensywności pików EPR. Swoistość detekcji potwierdzono za pomocą zmiataczy ROS oraz selektywnych inhibitorów enzymów generujących anion ponadtlenkowy.

Dane dotyczące stymulacji płytek krwi trombiną lub kolagenem w obecności selektywnego inhibitora, VAS2870, sugerują, że oksydazy NADPH są głównym źródłem anionów ponadtlenkowych płytek krwi w odpowiedzi na obu tych agonistów.