Wykorzystanie testu przesunięcia termicznego do badania wiązania substratu z selenoproteiną O
9 sierpnia 2024
Tutaj prezentujemy test przesunięcia termicznego, wysokoprzepustową technikę opartą na fluorescencji, używaną do badania wiązania małych cząsteczek z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania.
Naszym celem jest zbadanie aktywności biochemicznej białek o nieznanych funkcjach. Wiązanie kofaktora jest nie tylko niezbędne dla aktywności niektórych białek, ale może również wpływać na ich stabilność termiczną. Jednym z praktycznych zastosowań tego zjawiska jest wykorzystanie zmiany stabilności termicznej, mierzonej temperaturą topnienia białka, do analizy wiązania ligandów.
Test przesunięcia termicznego jest wszechstronnym narzędziem do badania interakcji białek z potencjalnymi kofaktorami lub lekami oraz do określania warunków stabilizujących krystalografię. Niektóre z jej zalet w porównaniu z innymi metodami przesiewania to stosunkowo prosta konfiguracja i wysoka przepustowość z płytkami 96 lub 384-dołkowymi. Selenoproteina O lub SelO jest ewolucyjnie konserwatywną pseudokinazą, która przenosi monofosforan adenozyny z ATP do substratów białkowych w modyfikacji potranslacyjnej znanej jako AMPylacja W tym protokole używamy TSA do analizy wiązania nukleotydów i metali z SelO.
Na początek przygotuj roztwór białka SelO za pomocą testu przesunięcia termicznego lub buforu TSA. Dozuj białko, małe cząsteczki i barwnik SYPRO Orange do odpowiednich dołków na płytce 384-dołkowej. Przykryj płytkę optycznie przezroczystą folią samoprzylepną i krótko obracaj płytkę o masie 1000 g przez jedną minutę w wirówce.
Następnie umieść płytkę w maszynie do PCR w czasie rzeczywistym i zaprogramuj ją tak, aby utrzymywała próbkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie wzrost temperatury o 0,5 stopnia na minutę do 95 stopni Celsjusza. Eksportuj dane z maszyny RTPCR dla względnych jednostek fluorescencji lub RFU w odniesieniu do temperatury. Korzystając z wybranego oprogramowania, wyodrębnij i wykreśl punkty danych do najwyższej intensywności zmierzonej dla każdej krzywej topnienia.
Określ temperaturę topnienia za pomocą pasowania sigmoidalnego Boltzmanna, aby uzyskać dane do określenia temperatury topnienia lub Tm. Krzywe denaturacji termicznej wykazały wzrost stabilności termicznej Escherichia coli SelO o 4 stopnie Celsjusza w obecności ATP z jonami magnezu i wzrost o 12 stopni Celsjusza w tym samym dla ATP z jonami manganu. Nie zaobserwowano jednak zmiany w stabilności termicznej po inkubacji z UTP, co wskazuje, że Escherichia coli SelO może nie wykazywać wykrywalnego wiązania z UTP. Kontrole bez białka, jak również bez barwnika, miały niski sygnał fluorescencji, który nie reagował na wzrost temperatury.
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono analizę przesunięcia termicznego (TSA), wysokoprzepustową technikę opartą na fluorescencji, służącą do badania wiązania małych cząsteczek z białkami. Metoda TSA jest szczególnie użyteczna przy analizie wiązania ligandów oraz określaniu warunków stabilizujących dla krystalografii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Interakcje białkowe
- Analiza stabilności termicznej
Wprowadzenie
- Wiązanie kofaktora jest niezbędne dla aktywności niektórych białek.
- Zmiany stabilności termicznej mogą wskazywać na wiązanie ligandu.
- Temperatura topnienia białek jest kluczowym pomiarem w TSA.
- Selenoproteina O (SelO) jest pseudokinazą biorącą udział w procesie AMPylacji.
Cel badania
- Badanie aktywności biochemicznej białek o nieznanych funkcjach.
- Wykorzystanie TSA do analizy wiązania nukleotydów i metali przez SelO.
- Identyfikacja warunków stabilizujących dla krystalografii białek.
Zastosowane metody
- Analiza przesunięcia termicznego (TSA)
- Detekcja oparta na fluorescencji
- Przesiewy wysokoprzepustowe z użyciem płytek 96- lub 384-dołkowych
- Analiza wiązania ligandów poprzez zmiany stabilności termicznej
Główne wyniki
- TSA skutecznie mierzy wiązanie ligandów z białkami.
- Analizowano oddziaływania SelO z nukleotydami i metalami.
- Zmiany stabilności termicznej skorelowano z wiązaniem ligandów.
- Metoda ta wykazała przewagę nad tradycyjnymi technikami przesiewowymi.
Wnioski
- Analiza przesunięcia termicznego (thermal shift assay) jest wszechstronnym narzędziem do badań interakcji białek.
- Pozwala ona uzyskać informacje na temat aktywności biochemicznej białek.
- TSA może ułatwić identyfikację warunków stabilizujących dla krystalografii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Analiza przesunięcia termicznego (TSA) umożliwia szybką, wysokoprzepustową ocenę wiązania ligandów oraz stabilności białek, co bezpośrednio wspiera wczesny etap walidacji celu i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków w biofarmacji. Poprzez ilościowe określanie oddziaływań substratów i kofaktorów z Selenoproteiną O, TSA dostarcza informacji służących zarówno do adnotacji funkcjonalnej, jak i identyfikacji warunków stabilizujących dla późniejszych badań strukturalnych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w krytycznych punktach procesu odkrywania, szczególnie w przypadku białek o wcześniej nieznanych funkcjach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę wiązania ligandów i kofaktorów z niecharakteryzowanymi białkami.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie specyficzności substratowej i zależności wiązania.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe przesunięcia stabilności termicznej.
- Dostarcza praktycznych danych do selekcji nowych celów białkowych w ramach portfela badawczego.
Przesiewy i opracowanie testów
- Umożliwia wysokoprzepustowy screening wielu warunków ligandowych w formacie płytkowym.
- Standaryzuje wyniki analizy poprzez ilościowe pomiary temperatury topnienia.
- Umożliwia powtarzalną ocenę oddziaływań białko-ligand w celu przygotowania do dalszych analiz.
- Wspiera identyfikację optymalnych warunków do badań strukturalnych i funkcjonalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki biochemiczne z funkcją białka istotną dla choroby w przypadku ustalenia specyficzności substratowej.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dla nowych celów terapeutycznych.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach dzięki wczesnemu wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
TSA znajduje się na styku wczesnego etapu odkrywania i identyfikacji wiodących związków, umożliwiając walidację celów opartą na hipotezach oraz wspierając późniejszy rozwój analiz i procesy biologii strukturalnej.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie wiązania ligandu i wymagań co do kofaktorów w celu wyjaśnienia funkcji białka.
- Przesiewy: Zapewnienie skalowalnych, powtarzalnych wyników do oceny związków i warunków.
- Analityka: Generowanie danych o temperaturze topnienia do analizy porównawczej w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Powiązanie charakterystyki biochemicznej z wyborem modelu przedklinicznego, jeśli jest to właściwe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferowanie szeroko stosowalnej platformy dla różnych celów białkowych i klas ligandów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w wyborze celu.
- Wartość operacyjna: Usprawnia konfigurację testów, zwiększa powtarzalność i wspiera przepływy pracy o wysokiej przepustowości.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz alokację kapitału poprzez wyjaśnienie relacji między celem a ligandem.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację nowych celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ilościowe dane o wiązaniu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu biochemii białek oraz projektowania testów opartych na fluorescencji.
- Wymagany jest dostęp do urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym lub kompatybilnych termocyklerów i czytników płytek.
- Konieczne jest stosowanie zestandaryzowanych protokołów w celu zapewnienia powtarzalności między zespołami oraz porównywalności danych.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych klas białek lub typów ligandów.
- Niezawodność pomiarów zależy od czystości i stabilności białka.
