Używanie R, Seurat i CellChat do analizy zestawu danych transkryptomicznych pojedynczych komórek gojenia się ran skóry myszy

W naszym laboratorium wykorzystujemy nowe narzędzia, takie jak transkryptomika jednokomórkowa i przestrzenna z biologią systemową i podejściami bioinformatycznymi, aby badać przestrzenną czasową dynamikę komórkową zróżnicowanych wyników leczenia. W ostatnich latach zaobserwowaliśmy szybkie zastosowanie transkryptomiki jednokomórkowej do badania gojenia się ran u ludzi i w organizmach modelowych, takich jak myszy. Pełna analiza zestawów danych z pojedynczych komórek jest niewystarczająca dla naukowców zajmujących się badaniami laboratoryjnymi, którzy mają niewielkie lub żadne doświadczenie w dziedzinie bioinformatyki. Oznacza to, że zbyt często zestawy danych z pojedynczych komórek są niedostatecznie wykorzystywane przez naukowców zajmujących się gojeniem się ran. Jest to pierwszy kompleksowy protokół, który zakłada brak wcześniejszego doświadczenia z bioinformatyką, który prowadzi użytkownika od pobrania zestawu danych do wyników odpowiednich analiz w kontekście badań nad gojeniem się ran. Nasz protokół powinien służyć jako szablon dla badaczy gojenia się ran, aby mogli pełniej analizować własne zestawy danych jednokomórkowych i być w stanie wydobyć nowe spostrzeżenia z publicznie dostępnych zestawów danych.

[Szalyn] Aby rozpocząć, przejdź do plików zestawów danych z repozytorium omnibus ekspresji genów, używając numeru dostępu GSE204777. Kliknij pierwszy zestaw danych zatytułowany GSM6190913. Przewiń do dołu GSM6190913 strony i pobierz trzy wymienione pliki, korzystając z linków FTP lub HTML. Korzystając z eksploratora plików komputera, przenieś pobrane pliki do katalogu o nazwie b1, upewniając się, że znajduje się on w katalogu roboczym. Pobierz informacje o ścieżce katalogu dla pobranych plików sekwencjonowania pojedynczych komórek. Teraz załaduj pliki sekwencjonowania pojedynczych komórek do środowiska roboczego. Następnie oddziel dane dotyczące ekspresji genów i multipleksowania HTO od roboczego zestawu danych. Utwórz obiekt Seurat, korzystając z danych ekspresji genów, jednocześnie odfiltrowując geny wykryte w mniej niż pięciu komórkach i komórkach z mniej niż 200 genami. W przypadku zestawów danych bez danych HTO utwórz obiekt Seurat z tymi samymi parametrami filtrowania i przełącz się na test ekspresji genów. Oblicz procent genu mitochondrialnego w każdej komórce i przypisz tę wartość jako zmienną metadanych. Wizualizacja rozkładu liczby genów, całkowitego RNA i procentowego udziału genów mitochondrialnych we wszystkich komórkach. Usuń komórki, których zawartość mitochondriów przekracza 25% za pomocą progu i wizualizuj zaktualizowane dystrybucje po odfiltrowaniu tych komórek o niskiej jakości. Wykrywanie prawdopodobnych dubletów za pomocą metody wyszukiwarki dubletów SC. Uruchom potok wyszukiwania dubletów SC przy użyciu poleceń i przypisz wynikowe wyniki dubletów jako nową zmienną metadanych. Teraz zwizualizuj rozkład wyników dubletów we wszystkich komórkach. Usuń wszystkie komórki z wynikiem dubletu powyżej 0,25 i zapisz oczyszczony obiekt Seurat jako plik RDS w katalogu roboczym. Przeprowadzanie normalizacji danych, skalowania i analizy składników głównych. Wizualizacja udziału wariancji w pierwszych 50 składnikach zasady. Grupuj komórki, używając pierwszych 13 głównych składników i rozdzielczości grupowania 0,1. Wykonaj jednorodne przybliżenie i projekcję rozmaitości lub redukcję UMAP w analizie sąsiadów, używając pierwszych 13 podstawowych składowych i ustaw liczbę początkową na 123. Teraz zwizualizuj grupowanie komórek na wykresie UMAP, a następnie adnotacje czasu i przestrzeni na wykresie UMAP. Następnie wygeneruj tabelę kojarzącą klastry komórek z adnotacjami czasu i przestrzeni nawinięcia. Określ tożsamości głównych typów komórek po obliczeniu genów o zróżnicowanej ekspresji między wszystkimi klastrami i przypisz wynikowe listy DEG do zmiennej przed zapisaniem ich jako rozdzielanego pliku tekstowego w katalogu roboczym. Teraz otwórz plik znaczników klastra zestawu danych w aplikacji arkusza kalkulacyjnego. Użyj Kreatora importu tekstu, aby ustawić przecinek jako ogranicznik i sformatować kolumny nazw genów jako tekst, aby zapobiec automatycznej konwersji nazw genów na daty. W arkuszu kalkulacyjnym uszereguj średnią kolumnę logarytmu dwóch FC od największej do najmniejszej, aby uporządkować wiersze, zmniejszając wartości podwójnej zmiany logarytmu, a następnie kolumnę klastra od najmniejszej do największej. Aby uporządkować wiersze, zwiększając liczbę klastrów Seurat, przefiltruj średnią kolumnę logarytmu dwa FC w celu uwzględnienia tylko wartości większych lub równych 2,5, a następnie przefiltruj kolumnę PCT 1 w celu uwzględnienia wartości większych lub równych 0,4. Następnie przefiltruj kolumnę PCT 2, aby uwzględnić wartości mniejsze lub równe 0,2. Na koniec przefiltruj kolumnę Skorygowana wartość P, aby uwzględnić wartości mniejsze lub równe 0,01. Teraz otwórz internetowe narzędzie do analizy wzbogacania Enrichr. Dla każdego klastra skopiuj listę genów o zróżnicowanej ekspresji do osobnego okna narzędzia Wzbogacanie i kliknij przycisk analizuj. Następnie kliknij kartę typów komórek powyżej danych wyjściowych analizy i skoncentruj się na pięciu pierwszych wzbogaceniach w trzech wyselekcjonowanych bazach danych znaczników komórek. Na podstawie najważniejszych wzbogaceń z analizy narzędzia Enrichr przypisz prawdopodobne tożsamości do ośmiu klastrów. Połącz klastry dwa i sześć w jedną adnotację oznaczoną jako fibroblasty i przypisz te adnotacje jako nową zmienną metadanych o nazwie typy komórek. Następnie zwizualizuj typy komórek z adnotacjami na wykresie UMAP i wyświetl lokalizację pogrubionych genów znacznika górnego klastra na serii wykresów UMAP. Wizualizuj geny o zróżnicowanej ekspresji górnego markera klastra na wykresie kropkowym pogrupowanym według oryginalnych numerów klastrów, a następnie ponownie geny górnego markera na wykresie kropkowym, tym razem pogrupowane według typów komórek z adnotacjami. Aby przygotować się do analizy szeregów czasowych, usuń adnotacje przestrzenne i uprość zestaw danych. Ponownie przypisz metadane czasu i przestrzeni rany do nowej zmiennej o nazwie DPW dla dni po zranieniu. Wizualizuj nowe grupowania kursów czasowych DPW na wykresie UMAP i generuj tabele pokazujące liczbę komórek każdego typu w każdej grupie DPW. Następnie przelicz liczbę komórek na proporcje, aby ocenić względne zmiany w składzie typu komórek podczas gojenia i zwizualizuj proporcje każdej kategorii DPW w każdym typie komórek. Na koniec zwizualizuj proporcje każdego typu komórki w każdej grupie DPW i zapisz końcowy obiekt Seurat zawierający wszystkie adnotacje i filtry jako plik RDS w katalogu roboczym. Wszystkie komórki w zestawie danych zostały wyraźnie zgrupowane w główne typy komórek oznaczone kolorami na wykresie UMAP, potwierdzając pomyślną adnotację na podstawie wzbogaconych sygnatur typów komórek. Wysoka ekspresja genów markerów górnych klastrów była zlokalizowana w odpowiednich klastrach typów komórek na wykresach UMAP. Wizualizacja na wykresie kropkowym potwierdziła, że najwyższe poziomy ekspresji genów markerów klastrowych były ograniczone do ich głównych typów komórek. Ułożony wykres słupkowy ujawnił, że neutrofile i makrofagi dominowały w pierwszym dniu po zranieniu, podczas gdy fibroblasty, komórki nabłonkowe i śródbłonka stały się bardziej rozpowszechnione w późniejszych punktach czasowych, odzwierciedlając znaną kaskadę komórkową gojenia się ran.