Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

Cześć, jestem Kevin Won. Jestem studentem studiów magisterskich inżynierii w Biofluids Lab na Uniwersytecie Cornella. Dzisiaj opowiem o wykorzystaniu mikroprzepływowego urządzenia opartego na agarozie do badania wpływu EGF (czynnika wzrostu naskórka) na murine neurostem cells (neuronalne komórki macierzyste myszy).

Urządzenie składa się zasadniczo z trzech kanałów mikroprzepływowych, z których każdy ma szerokość 150 µm. EGF jest wpompowywany do jednego z kanałów bocznych, a bufor do drugiego kanału bocznego. Pozwala to na utworzenie statycznego liniowego gradientu chemicznego w poprzek kanału centralnego.

Ponieważ EGF łatwo dyfunduje przez żel agarowy, komórki macierzyste neuronów wysiewa się w kanale środkowym, a postępy ich migracji monitoruje za pomocą mikroskopu. Urządzenia składają się zatem w zasadzie z górnej warstwy z pleksiglasu, w której znajdują się wszystkie wloty i wyloty do podłączenia rurek. Pod nią znajduje się membrana z żelu agarowego, zawierająca cztery wzorowane urządzenia.

Całość jest otoczona dystansem z PDMS, co gwarantuje stałą grubość w całym urządzeniu. PDMS oraz żel są montowane na szkiełku przedmiotowym pokrytym ect. Pomaga to komórkom przylegać do szkiełka.

Dodatkowo, płyta ze stali nierdzewnej służy do montażu całego urządzenia, które następnie skręcamy za pomocą śrub. Linia komórkowa typu dzikiego została przetransfekowana wektorem retrowirusowym w celu nadekspresji receptora EGF typu dzikiego, natomiast linia komórkowa delta została przetransfekowana zmutowaną wersją receptora EGF, która umożliwia jego konstytutywną aktywność bez liganda EGF. Dobrze, zacznę zatem od wyjaśnienia procesu montażu naszego urządzenia mikroprzepływowego.

Najpierw umieściłam przekładkę z PDMS wokół elementów wypukłych krzemowych mikrokanałów w naszych matrycach. Teraz odważę 0,3 g agarozy. Następnie odmierzę 10 ml pożywki niezależnej od CO2 i dodam ją do agarozy.

Następnie będę pipetować próbkę w górę i w dół, aby wymieszać proszek agros z pożywką niezależną od CO2. Teraz możemy przenieść naczynie do mikrofalówki. Jak widać, agros został upłynniony, choć wciąż pozostało kilka grudek.

Spróbuję zakręcić próbką, aby rozpuścić granulki i pozbyć się pęcherzyków powietrza. Teraz wlewam stopiony agaros na elementy reliefowe silikonowej matrycy, a następnie biorę sterylną szkiełko przedmiotowe i kładę je na dystansie z PDMS. Kładę je pod kątem, aby spróbować wypchnąć większość pęcherzyków powietrza z żelu agarozowego.

Następnie wywarłem nacisk i będę go kontynuować, aż powłoka agarozy stężeje. Po jednej lub dwóch minutach stężała. Teraz usunę nadmiar agarozy z szkiełka.

Kolejnym krokiem jest delikatne zsunięcie szkiełka przedmiotowego, które może zostać teraz zutylizowane. Teraz spróbuję delikatnie przenieść wzór agros na szkiełko przedmiotowe, które wcześniej pokryłem fibronektyną. Używam tej sterylnej plastikowej folii, aby pomóc mi zdjąć wzór agros wraz z przekładką PDMS, a następnie przeniosę wzór agros z kanałami skierowanymi w dół w stronę szkiełka.

Teraz, gdy urządzenie jest mocno przymocowane do szkiełka przedmiotowego, wykonam otwory w poszczególnych zbiorniczkach, aby plastikowy rozdzielacz miał dostęp do kanałów. Użyję do tego niewielkiego metalowego dziurkacza. Proces wykonywania otworów w urządzeniu został zakończony.

Dodam 500 µL pożywki niezależnej od CO2, aby zapobiec wysychaniu mikrokanałów, a następnie odczekam od jednej do dwóch minut. Po upływie jednej lub dwóch minut spróbuję odprowadzić nadmiar pożywki, a następnie wyrównam otwory wykonane w matrycy z otworami wlotowymi i wylotowymi w rozdzielaczu z pleksiglasu. Po wyrównaniu otworów mocno docisnę całość, aby stworzyć szczelną uszczelkę.

Teraz kładę pleksiglasowy rozdzielacz na uchwytach ze stali nierdzewnej i delikatnie złączę urządzenie za pomocą śrub. Bardzo uważam, aby nie dokręcić śrub zbyt mocno, ponieważ mogłoby to zmiażdżyć kanały; wkręcam śruby zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zapobiec przesunięciu się żelu Agarose wewnątrz. Pobiorę 1 mL medium i użyję tej strzykawki do przetestowania urządzenia.

Jak widać, wstrzykuję ciecz do każdego mikrokanału i sprawdzam, czy wypływa ona z każdego otworu wylotowego. W tej chwili umieściłem zmontowane urządzenie w komorze inkubacyjnej mikroskopu. Jest ona utrzymywana w temperaturze 37 °C, co pozwoli rozgrzać urządzenie i przygotować je do etapu wysiewania komórek.

Jak widać, przeprowadziłem już dwie rurki pompy perystaltycznej przez układ. Obecnie płuczę rurki roztworem PBS w celu przygotowania do naszych eksperymentów. Teraz przejdziemy do ustawienia rurek.

Przewleczkę rurki pompy parasolowej przez nakrętki, w których wykonano już otwory. Każda rurka ma określoną liczbę nacięć, co pozwala mi zidentyfikować zarówno wlot, jak i wylot rurki. Rurka z czterema nacięciami zostanie wykorzystana do podania 10 nanogram per mil.

Teraz przytwierdzę rurki z roztworem EGF do urządzenia. Przymocuję je do każdego urządzenia zgodnie z liczbą posiadanych wycięcia, co odpowiada ilości pobieranego roztworu.

Teraz podłączam rurkę wylotową. Używamy przezroczystego wężyka typu tigon, aby upewnić się, że medium rzeczywiście przepływa przez rurkę wylotową i nie ma żadnych zatorów w kanale. Teraz uruchomię pompy perystaltyczne.

Przystępuję teraz do procedury wysiewania komórek do kanału środkowego. Zacznę od usunięcia nadmiaru pożywki z kanału czujnika. Teraz będę mogła zobaczyć komórki.

Komórki znajdują się już w zawiesinie w pożywce niezależnej od CO2. Wprowadziłem 60 µL do wlotu kanału środkowego oraz 20 µL do wylotu. Mamy nadzieję, że komórki zostaną osadzone dzięki przepływowi grawitacyjnemu.

Powtórzę tę procedurę dla dwóch pozostałych kanałów czułych, a teraz przejdziemy do obserwacji pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy osadzanie komórek przebiegło pomyślnie. Komórki przyległy teraz do szkiełka przedmiotowego i w ciągu kilku minut zaczną się rozprzestrzeniać oraz przyjąć swoją charakterystyczną morfologię. Omówiliśmy dzisiaj montaż samego urządzenia, przygotowanie odczynników oraz techniki mikroskopowe, których używam do obrazowania migracji komórek wewnątrz urządzenia.

Podsumowując, mamy nadzieję, że urządzenie to znajdzie znacznie szersze zastosowanie, w szczególności w warunkach klinicznych. Rysunek 1 przedstawia w osi poziomej trajektorie komórek C 17.2, a w osi pionowej zwiększające się stężenia EGF.

Przedstawiono trajektorie różnych szczepów komórek C 17.2 wykorzystanych w naszych eksperymentach przy tym samym stężeniu EGF. Dane dla komórek rodzicielskich wykazują szczyt ruchliwości przy gradiencie stężeń EGF wynoszącym 10 ng/ml, co wskazuje na nasycenie receptorów ligandem przy wyższym stężeniu EGF. Natomiast dane dla typu dzikiego wykazują wzrost ruchliwości przy stężeniu EGF wynoszącym 100 ng/ml.

Wskazuje to na to, że receptory nie ulegają nasyceniu przy wyższych stężeniach EGF. Jest to logiczne, ponieważ linie te zostały zaprojektowane tak, aby wykazywać nadekspresję receptora EGF. Wreszcie dane dla linii komórkowej delta wskazują, że ruchliwość komórek jest w przybliżeniu niezależna od stężenia EGF.

Jest to również spodziewane, ponieważ zmutowane receptory EGF zostały zaprojektowane tak, aby aktywowały się niezależnie od obecności EGF.