Ekstrakcja i oczyszczanie tkanek Przygotowanie próbek mysiego rdzenia kręgowego
11 kwietnia 2025
To badanie przedstawia protokół ekstrakcji i przygotowania oczyszczonych próbek całego mózgu i rdzenia kręgowego z zachowanymi sygnałami fluorescencyjnymi, zwiększając wydajność eksperymentu i integralność danych w celu przyspieszenia badań neurobiologicznych.
Nasze badania koncentrują się na tym, w jaki sposób ośrodkowy układ nerwowy pośredniczy w funkcjach poznawczych i współdziała z układem odpornościowym. Naszym celem jest udoskonalenie metod badania mózgu i rdzenia kręgowego, odpowiadając na fundamentalne pytania dotyczące tych interakcji. Metody te utrzymują cały mózg i rdzeń kręgowy w stanie nienaruszonym, co pomaga nam dokładniej mapować komórkę za pomocą oczyszczania tkanek. Sprawia również, że proces jest szybszy i dokładniejszy, skracając czas i zmniejszając liczbę błędów w porównaniu z tradycyjnymi metodami cięcia i obrazowania.
Zmapowaliśmy mózg i obszary rdzenia kręgowego połączone z płucami, uzyskując . Nasze badania skupią się na zbadaniu komunikacji neuroimmunologicznej między mózgiem, rdzeniem kręgowym i płucami. I jak ta interakcja wpływa na odpowiedź immunologiczną.
[Instruktor] Na początek przymocuj kończyny myszy do szerokiej akrylowej tablicy za pomocą stalowych zacisków. Za pomocą nożyczek przetnij skórę między dwiema kośćmi udowymi i kontynuuj cięcie w górę, aż dojdziesz do przepony. Otwórz obie strony klatki piersiowej przez przeponę, używając nożyczek i prostych kleszczy, aby odsłonić serce. Wprowadzić igłę infuzyjną o średnicy 0,7 milimetra przymocowaną do rurki perfuzyjnej do lewej komory i wykonać nacięcie o średnicy od jednego do dwóch milimetrów w wyrostku prawego przedsionka. Po perfuzji oddziel skórę na grzbiecie i głowie myszy za pomocą nożyczek okulistycznych. Przeciąć kręgosłup w miejscu, w którym linia łącząca górne tylne krawędzie obu kończyn przecina się z kręgosłupem. Usuń tkankę mięśniową i tłuszczową z szyi i grzbietu myszy, aby odsłonić kręgosłup i czaszkę. Nożyczkami żylnymi przeciąć wzdłuż szczeliny linii środkowej między lewą i prawą stroną kręgosłupa i rdzenia kręgowego od dolnego końca kanału kręgowego. Następnie usuń górną część i obustronne strony odciętego kręgosłupa, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Powtarzaj kroki, aż dotrzesz do połączenia mózgowego. Umieść końcówkę jednego ostrza nożyc żylnych między otworem wielkim a mózgiem. Przesuń i przetnij wzdłuż szwu śródstrzałkowego, aby otworzyć czaszkę. Użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę i odsłonić mózg. Teraz za pomocą kleszczy i nożyczek żylnych usuń tkankę rdzenia kręgowego mózgu myszy z końca czaszki. Użyj kleszczy preparacyjnych, aby usunąć błonę rdzenia kręgowego pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie, za pomocą szwów, przymocuj próbkę rdzenia kręgowego mózgu do płytki mocującej. Dodać co najmniej 20-krotność objętości próbki wynoszącej 4% paraformaldehydu. Po utrwaleniu wyrzucić paraformaldehyd i trzykrotnie przemyć próbkę PBS. Na początek umocuj wyekstrahowany rdzeń kręgowy mózgu myszy w paraformaldehydzie. W przypadku roztworu do usuwania lipidów należy zmieszać roztwory A i B w stosunku masowym dziewięć do jednego. Dodaj 50 mililitrów roztworu do usuwania lipidów do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i umieść w niej utrwaloną tkankę. Po inkubacji w roztworze C zmienić roztwór i umieścić szalkę hodowlaną z próbką całkowicie zanurzoną w roztworze C na kasecie świetlnej z linią skali. Aby przygotować roztwór żelu, dodaj 147 gramów roztworu C i trzy gramy agarozy do szklanej butelki o pojemności 200 mililitrów. Dobrze wymieszaj składniki za pomocą pręta mieszającego, a następnie podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. Przenieś roztwór żelu do pieca laboratoryjnego ustawionego na 37 stopni Celsjusza. Wlej do formy głęboką na dwa milimetry warstwę roztworu żelu hartowanego o temperaturze 37 stopni Celsjusza i schładzaj go w lodówce o czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut, aż stanie się półstały. Umieść próbkę o dopasowanym współczynniku załamania światła w formie i dodaj roztwór żelu do poziomu lub nieco poniżej górnej części próbki. Umieść formę z powrotem w lodówce o czterech stopniach Celsjusza na dwie godziny. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i ponownie wstaw do lodówki. Usuń szkiełko nakrywkowe pęsetą i wyjmij osadzoną próbkę. Dodaj 30 mililitrów roztworu do obrazowania do 50-mililitrowej probówki i zanurz próbkę w roztworze. Nałożyć klej 502, aby mocno przymocować próbkę do uchwytu próbki, przed zamocowaniem uchwytu na urządzeniu do obrazowania. Uruchom oprogramowanie do skanowania i wybierz poziom powiększenia 4X w sekcji powiększenia. Kliknij przycisk kalibracji, aby aktywować tryb kalibracji. Kliknij przycisk podglądu, aby przejść do trybu podglądu. Następnie kliknij przycisk ruchu w kierunku Z, aby powoli przesuwać próbkę w górę od dna komory próbki, aż wygenerowany arkusz świetlny przejdzie przez próbkę. Wybierz odpowiedni kanał laserowy i opcję trybu oświetlenia. Wybierz kierunek ścieżki skanowania dla próbki. Kliknij przycisk automatycznego skanowania, aby rozpocząć przechwytywanie obrazów próbki. Protokół z powodzeniem zachował cały mózg myszy i rdzeń kręgowy, zachowując nienaruszone sygnały fluorescencyjne w celu uzyskania wyraźnego obrazowania. Obrazowanie fluorescencyjne próbki rdzenia kręgowego mózgu wyraźnie uwidoczniło szczegółowe struktury neuronalne. Obrazy w większym powiększeniu zapewniły lepszą wizualizację pojedynczych komórek znakowanych fluorescencyjnie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół ekstrakcji i przygotowania przejaśnionych próbek całego mózgu oraz rdzenia kręgowego z zachowaniem sygnałów fluorescencyjnych. Zastosowane podejście zwiększa wydajność eksperymentalną i pozwala zachować integralność danych w celu rozwoju badań z zakresu neuronauki. Opracowane metody stanowią szybszą i dokładniejszą alternatywę dla tradycyjnych technik sekcjonowania i obrazowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- neuroimmunologia
- techniki przejrzystości tkanek
Wprowadzenie
- Badania nad rolą ośrodkowego układu nerwowego w funkcjach poznawczych.
- Analiza oddziaływań między mózgiem, rdzeniem kręgowym a układem odpornościowym.
- Rozwiązanie fundamentalnych pytań dotyczących komunikacji neuroimmunologicznej.
Cel badania
- Udoskonalenie metod badania struktur mózgu i rdzenia kręgowego.
- Ułatwienie mapowania struktur komórkowych w tkankach nienaruszonych.
- Zmniejszenie liczby błędów i czasu przetwarzania w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Zastosowane metody
- W badaniu zastosowano protokół przejaśniania tkanek dla próbek mózgu i rdzenia kręgowego myszy.
- Wykorzystano całe tkanki mózgu i rdzenia kręgowego do szczegółowego mapowania komórkowego.
- Proces obejmował kilka krytycznych etapów, w tym perfuzję i fiksację próbek, w celu zachowania sygnałów fluorescencyjnych.
- Zastosowano systematyczne podejście do zatapiania i obrazowania próbek.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie zachował fluorescencję, umożliwiając wyraźne obrazowanie struktur neuronalnych.
- Zwizualizowano szczegółowe struktury neuronalne, co dostarczyło informacji na temat połączeń w mózgu i rdzeniu kręgowym.
- Ulepszone obrazowanie pozwoliło na obserwację poszczególnych znakowanych komórek, co przyczyniło się do lepszego zrozumienia neuroanatomii.
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje, że nienaruszone oraz przejrzyste próbki mózgu i rdzenia kręgowego mogą znacząco poprawić jakość obrazowania.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia interakcji neuroimmunologicznych.
- Wnioski mają zastosowanie w badaniu mechanizmów neuronalnych w stanach zdrowia i choroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zachowanie nienaruszonej łączności mózgowo-rdzeniowej dzięki zaawansowanemu utrudnianiu tkanki umożliwia kompleksowe mapowanie oddziaływań neuronalnych i immunologicznych, rozwiązując tym samym kluczowy problem w walidacji celów w OUN. Niniejszy protokół optymalizuje przygotowanie próbek i obrazowanie, ograniczając błędy manualne i przyspieszając akwizycję danych w badaniach wczesnego odkrywania oraz badaniach translacyjnych. Zwiększona wierność obrazowania wspiera pewność predykcyjną w badaniach mechanistycznych oraz segregację portfolio w programach neuroimmunologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mapowanie obwodów neuronalnych i interfejsów odpornościowych w nienaruszonych tkankach OUN z wysoką rozdzielczością.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez zachowanie relacji przestrzennych, które są kluczowe dla walidacji celów.
- Ułatwia badanie opartych na hipotezach szlaków neuroimmunologicznych istotnych dla modeli chorób.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne próbki całych organów do późniejszych etapów obrazowania.
- Dostarcza ilościowe dane z obrazowania wysokotreściowego (high-content imaging), odpowiednie do analizy porównawczej.
- Poprawia gotowość testów poprzez zachowanie integralności sygnału fluorescencyjnego podczas przetwarzania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z badaniami systemowymi dotyczącymi chorób, umożliwiając wizualizację połączeń między OUN a układem odpornościowym.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez zachowanie kontekstu anatomicznego.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne, umożliwiając dokładniejsze modelowanie mechanizmów neuroimmunologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół łączy etap wczesnego odkrywania z badaniami przedklinicznymi, wspierając identyfikację związków wiodących oraz badania mechanistyczne w dziedzinie neuroimmunologii.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie analizy nienaruszonych tkanek.
- Screening: Standaryzuje przygotowanie próbek w celu uzyskania powtarzalnych, ilościowych wyników obrazowania.
- Analityka: Dostarcza wielokanałowe dane obrazowe o wysokiej rozdzielczości do rzetelnych porównań statystycznych.
- Badania translacyjne: Zachowuje wierność anatomiczną i molekularną w celu dopasowania biomarkerów i modelowania chorób.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Ustanawia skalowalny, wielokrotnego użytku schemat postępowania w zakresie oczyszczania tkanek OUN i obrazowania w ramach różnych programów badawczych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów w OUN.
- Wartość operacyjna: Usprawnia przetwarzanie próbek, zwiększa powtarzalność i wspiera obrazowanie wysokoprzepustowe.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie bardziej świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach w portfolio neuroimmunologicznym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów ukierunkowanych na OUN i modulację odporności.
Kwestie dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w preparatyce OUN, utrwalaniu i utlenianiu tkanek (tissue clearing) oraz zaawansowanych technikach obrazowania.
- Wymaga dostępu do wyspecjalizowanych platform obrazowania i infrastruktury analitycznej.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności przygotowania próbek i protokołów obrazowania.
- W zależności od celu badań może być wymagana adaptacja metody dla różnych modeli zwierzęcych lub typów tkanek.
- Potencjalne ograniczenia obejmują problemy z integralnością tkanki oraz konieczność ostrożnego obchodzenia się z próbkami w celu zachowania sygnałów fluorescencyjnych.
