Różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES) z wykorzystaniem metody wiszącej kropli

Komórki macierzyste posiadają niezwykły potencjał do przekształcania się w wiele różnych typów komórek w organizmie, pełniąc rolę swoistego systemu naprawczego ciała. Teoretycznie mogą one dzielić się w sposób nieograniczony, aby uzupełniać inne komórki.

Podczas podziału komórki macierzystej każda nowa komórka ma potencjał, aby pozostać komórką macierzystą lub stać się innym typem komórki o bardziej wyspecjalizowanej funkcji. Ta obiecująca dziedzina nauki skłania badaczy do analizy możliwości zastosowania terapii opartych na komórkach w celu leczenia chorób in vitro. Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych zachodzi, gdy komórkiom pozwala się agregować w kulturze zawiesinowej.

Wobec braku embrionalnych fibroblastów mysich oraz czynnika hamującego białaczkę, agregaty komórkowe te nazywa się ciałami embrionalnymi. Metoda wiszącej kropli jest jedną z efektywnych procedur różnicowania komórek macierzystych w ciała embrionalne in vitro. Dzień dobry, nazywam się Sha Juan i pracuję w dziale medycyny sercowo-naczyniowej na Uniwersytecie Stanforda.

Dzisiaj przedstawimy procedurę indywidualnej różnicowania komórek macierzystych zarodkowych w ciała embroidalne z wykorzystaniem metody kropelkowej. Zazwyczaj stosujemy tę metodę do różnicowania komórek macierzystych zarodkowych w kardiomiocyty. Procedura ta obejmuje następujące etapy: przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek macierzystych zarodkowych, tworzenie kultur kropelkowych, przenoszenie kultur kropelkowych na płytki o bardzo niskim stopniu przywierania oraz wysiewanie ciał embroidalnych na płytki pokryte żelatyną.

Zacznijmy zatem. Pierwszym krokiem procedury jest przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek macierzystych zarodkowych. Ponieważ hodujemy niezróżnicowane komórki macierzyste zarodkowe na fibroblastach zarodkowych myszy, musimy oddzielić komórki i odizolować je od fibroblastów.

Aby to osiągnąć, poddajemy komórki trypsynizacji zgodnie ze standardowymi procedurami. Po zakończeniu traktowania trypsyną dodajemy pożywkę dla embrionalnych komórek macierzystych myszy w celu neutralizacji trypsyny. Następnie przenosimy zawiesinę komórkową do probówki stożkowej o pojemności 15 ml.

Następnie rozbij kolonie komórek, pipetując je w górę i w dół przy dnie probówki, aż do uzyskania drobnej zawiesiny komórek bez widocznych grudek. Teraz wirować komórki przy 1000 RPM przez pięć minut. Po wirowaniu odessać supernatant i zawiesić komórki w 10 ml pożywki dla mysich komórek ES (mouse ES cell Medium).

Przenieś zawiesinę komórkową do kolby T 75 uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną i inkubuj w temperaturze 37°C przy 5% CO2 przez jedną godzinę. Po godzinie fibroblasty przyczepią się do płytki, natomiast komórki macierzyste pozostaną w medium. Odessij medium pipetą, aby zebrać komórki macierzyste.

Wiruj komórki przy 1000 RPM przez pięć minut, a następnie odessij pożywkę. Następnie dodaj kolejne 10 ml pożywki różnicującej i resuspenduuj komórki poprzez wielokrotne pipetowanie, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek. Policz komórki, używając hemosytometru.

Teraz możemy przystąpić do hodowli zawiesiny komórkowej metodą wiszącej kropli. Aby rozpocząć hodowlę w wiszącej kropli, należy użyć medium różnicującego do rozcieńczenia zawiesiny komórek macierzystych do stężenia 500 komórek na 20 µL. Następnie należy odwrócić pokrywkę płytki do hodowli tkanek o średnicy 150 mm.

Następnie nanieś pipetą 20 µL zawiesiny komórkowej na wewnętrzną powierzchnię pokrywki płytki. Używając pipety wielokanałowej, dodaj 10 ml PBS na płytkę. Szybko odwróć pokrywkę płytki i delikatnie połóż ją na płytce, aby utworzyć krople wiszące.

Po założeniu pokrywki płytki, ostrożnie przenieś ją do inkubatora. Pozostaw komórki w spokoju na dwa dni. Po zakończeniu inkubacji przejdziemy do przeniesienia hodowli w kropli wiszącej na płytki o ultra niskiej adhezji.

Po dwóch dniach ostrożnie odwróć pokrywę płytki, następnie odessaj 180 µL świeżego pożywki do różnicowania i nanieś kilka kropel na płytkę 96-dołkową o ultra niskim przywieraniu (ultra low attachment). Następnie pobierz krople pipetą i przenieś je pojedynczo do płytki 96-dołkowej. Umieść płytki w inkubatorze na trzy dni, nie zakłócając ich stanu.

Ciała embrionów będą nadal rosnąć, przyjmując kształt kuli. Po zakończeniu inkubacji będziemy gotowi do wysiewania ciał embrionów, aby wspomóc ich dalszą różnicowanie.

Przenosimy je na płytkę 48-dołkową powlekaną żelatyną. Aby to zrobić, najpierw powlekamy każdy dołek płytki 300 µL 0,1% żelatyny. Po dodaniu żelatyny inkubujemy płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.

Następnego dnia odessaj żelatynę z płytki 48-dołkowej. Następnie dodaj 300 µL medium do różnicowania do każdego dołka. Teraz przenoś pojedynczo ciała zarodkowe z płytki 96-dołkowej na płytki 48-dołkowe powlekane żelatyną.

Zazwyczaj zmieniamy pożywkę następnego dnia, a następnie co drugi dzień, aby utrzymać przeżywalność komórek. Metody tej używamy do poszukiwania lepszych protokołów różnicowania embrionalnych komórek macierzystych. W przypadku kardiomiocytów zaprezentowaliśmy właśnie sposób przeprowadzania różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem hodowli w kropelkach wiszących.

Metoda ta jest skuteczna, ponieważ okrągłe dno wiszącej kropli umożliwia agregację embrionalnych komórek macierzystych, zapewniając tym samym odpowiednie środowisko do powstawania ciał embrionalnych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że liczbę embrionalnych komórek macierzystych zagregowanych w wiszącej kropli można kontrolować poprzez zmianę liczby komórek w początkowej zawiesinie komórkowej. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.