Efektywna różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe

Ogólnym celem tej procedury jest różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe. Najpierw należy hodować embrionalne komórki macierzyste myszy na pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy, uzupełniając pożywkę o czynnik hamujący białaczkę (leukemia inhibitory factor). Następnie procesy normalizacji należy wzmocnić poprzez dodanie noggin, bFGF oraz FGF8. Specyfikację neuronów ruchowych indukuje się poprzez inkubację z kwasem retinowym oraz agonistą receptora smoothened, po czym następuje wydłużanie aksonów i dojrzewanie neuronów ruchowych.

Na koniec należy zastosować mikroskopię immunofluorescencyjną w celu zbadania zróżnicowanych komórek MES, które wykazują silną fluorescencję GFP. Generowanie dużych ilości neuronów ruchowych ułatwiło badania nad chorobami neuronów ruchowych w porównaniu z obecnymi protokołami. To podejście do różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe jest bardziej wydajne. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat rdzeniowego zaniku mięśni.

Metodę tę można zastosować również w innych chorobach neuronów ruchowych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne. Aby wysiać pierwotne embrionalne fibroblasty mysie, należy pokryć cztery 100-milimetrowe płytki do hodowli tkankowej 8 ml 0,1% roztworu żelatyny. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej należy odlać nadmiar płynu. Następnie jedną ampułkę mitomycyny C w aktywowanych PMEF należy rozcieńczyć w 40 ml pożywki PMEF, wysiać na cztery płytki i hodować do jednego tygodnia.

Następnie rozmroź jedną fiolkę komórek MES w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Przemyj komórki pięcioma mililitrami pożywki E ES w probówce o pojemności 15 ml. Następnie wiruj przez pięć minut przy 800 RPM.

Odssać supernatant i resuspender komórki MES w 20 mililitrach pożywki ES ze świeżo dodanym czynnikiem hamującym białaczkę (leukemia inhibitory factor). Następnie usunąć 10 mililitrów pożywki z kultur PMEF i zastąpić ją 10 mililitrami zawiesiny komórek ES HBG three. Monitorować postęp wzrostu komórek MES w czasie: od małych kolonii po 24 godzinach do kolonii o średnicy około 100 mikrometrów po 72 godzinach od wysiewania.

Wymieniać pożywkę codziennie, aby utrzymać proliferację komórek niezbędną do indukcji komórek MES. Różnicowanie w neurony ruchowe. Mysie embrionalne komórki macierzyste muszą zostać najpierw oddzielone od komórek zasilających PMEF, a następnie hodowane w warunkach zawiesiny w dniu indukcji.

Dla każdej hodowli ES o średnicy 100 milimetrów przygotować kolbę T 25 pokrytą 0,1% żelatyną. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej usunąć nadmiar żelatyny i przemyć trzy razy PBS. Następnie ostrożnie aspirować medium z hodowli ES, dbając o to, aby nie usunąć słabo przytwierdzonych kolonii. Następnie przemyć raz 10 mililitrami PBS.

Aby oddzielić komórki MES od PMEF, należy dodać trzy mililitry 0,25% trypsyny EDTA i inkubować przez trzy do pięciu minut. W temperaturze 37 °C należy sprawdzić, czy komórki macierzyste oraz PMEF oddzieliły się od płytki. Następnie należy dodać 15 mililitrów świeżej pożywki ES i rozbić kolonie za pomocą pipetowania.

Przenieś zawiesinę komórkową do przygotowanej kolby T25 powlekanej żelatyną i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37°C, aby komórki PFS przytwierdziły się do żelatynizowanej powierzchni. Następnie zbierz pływające komórki MES do probówki o pojemności 50 ml i odwirowuj w celu uzyskania osadu. Resuspenduj komórki w 10 ml pożywki do różnicowania neuronalnego.

Policz komórki w medium za pomocą hemosytometru, a następnie wysiej je na 100 milimetrowy talerzyk do kultur zawiesinowych w celu różnicowania. W pierwszym dniu zweryfikuj pod mikroskopem, czy komórki MES utworzyły małe, pływające agregaty zwane ciałami zarodkowymi. Ponieważ wszelkie resztki PMEF mogą przylgnąć do talerzyka, przenieś zawiesinę komórek ES wraz z medium do probówki o pojemności 15 mililitrów, a następnie wiruj przy 500 RPM przez trzy minuty.

Aby zebrać ciałka embrionalne, ostrożnie odessaj pożywkę, dodaj 10 ml świeżej pożywki do różnicowania neuronalnego do osadu EB, a następnie przenieś komórki do nowej pustej naczyniowej kultury bakteryjnej na 24 godziny w celu różnicowania. W drugim dniu zakręć naczyniem hodowlanym i przenieś pożywkę oraz EB do probówki o pojemności 15 ml. Pozostaw EB do osadzenia pod wpływem grawitacji, następnie ostrożnie odessaj pożywkę i resuspenduj EB w 10 ml pożywki do różnicowania neuronów ruchowych.

Kulturować EBS w nowej szalce bakteriologicznej przez pięć dni podczas różnicowania. W siódmym dniu sprawdzić, czy średnica EBS wynosi około 150 do 200 µm i czy wykazują silne sygnały GFP po różnicowaniu. W piątym dniu, dwa dni przed dysocjacją EBS, umieścić okrągłe szkiełka zakrywkowe o średnicy 12 mm na dnie płytki 24-dołkowej.

Następnie dodać 0,5 ml poly DL ornithine o stężeniu 100 µg/ml i inkubować w temperaturze 4°C przez noc. Odessać poly DL ornithine i wysuszyć płytki oraz szkiełka podstawowe w komorze do hodowli tkanek. Trzykrotnie przepłukać dołki płytki wodą dwukrotnie destylowaną.

Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, aby pokryć szkiełka podstawowe. Przygotuj świeże rozcieńczenie lamininy mysiej o stężeniu 2 µg/mL w 5 mL schłodzonego 1x PBS. Dodaj 0,5 mL na studzinkę i inkubuj w temperaturze 4 °C przez noc.

Przemyć dwukrotnie PBS po różnicowaniu. W siódmym dniu zebrać EBS do probówki o pojemności 15 ml i pozwolić na osadzenie się EBS pod wpływem grawitacji. Po czterokrotnym przemyciu PBS dodać jeden mililitr ACU max do EBS, delikatnie wymieszać i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać nadmiar ACU max pokrywający EBS.

Następnie dodaj 3 ml pożywki MND i rozdziel EBS, pipetując około 20 razy przy użyciu mikropipety o objętości 1 ml, następnie inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko do komórek do probówki o wymiarach 12 x 75 mm. Powtórz ten etap dysocjacji z pozostałymi skupkami i komórkami zatrzymanymi przez filtr, aby zwiększyć uzysk pojedynczych komórek w końcowej zawiesinie o objętości 6 ml. Delikatnie wymieszaj zawiesinę pojedynczych komórek i policz komórki za pomocą komory countingowej (hemocytometru), a następnie rozcieńcz komórki w pełnej pożywce MND do gęstości 2 × 10⁵ komórek/ml i wysiej na płytki.

0,5 ml zawiesiny komórek na dołek w przygotowanych płytkach 24-dołkowych zawierających szkiełka podstawowe pokryte poli-DL-ornityną i lamininą. Zróżnicowane komórki wytwarzają długie neuryty po dwóch dniach. W hodowli HBG three jest linią komórek ES pochodzącą z myszy transgenicznej wykazującej ekspresję EGFP pod kontrolą promotora HB nine specyficznego dla neuronów ruchowych, zgodnie z określonym protokołem różnicowania.

Komórki MES mogą być wykorzystywane do wyprowadzania neuronów ruchowych. Niezróżnicowane komórki MES tworzą okrągłe kolonie na powierzchni warstwy pokarmowej fibroblastów. Wykazują one słabą ekspresję GFP.

Te komórki MES oddzielono od warstw pożywczych i hodowano na naczyniach o niskim stopniu przylegania w celu utworzenia ciał embrionalnych. Zróżnicowane komórki MES wykazywały silną fluorescencję GFP po siódmym dniu. Zróżnicowane EBS poddano dysocjacji i wysiano na płytki pokryte poli-DL-ornityną i lamininą.

Po dwóch dniach hodowli zróżnicowane komórki wysuwają długie neuryty z ciał komórkowych komórek wysianych na podłoże; neurony ruchowe pochodzące z komórek MES można scharakteryzować za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Komórki te, wykazujące pozytywny sygnał GFP, wykazują ekspresję pan-neuronalnego markera neurofilamentu oraz dwóch markerów specyficznych dla neuronów ruchowych: Eyelid one i cholinoacetylotransferazy. Barwienie DPI służy do wybarwienia jąder komórkowych.

Nasz dwuetapowy protokół różnicowania stanowi wydajną metodę różnicowania komórek MES w rdzeniowe neurony ruchowe. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak efektywnie różnicować embrionalne komórki macierzyste myszy w neurony ruchowe. Podsumowując, należy pamiętać, że wysoka jakość embrionalnych komórek macierzystych myszy jest najistotniejszym parametrem dla efektywnego generowania neuronów ruchowych.