Metoda MODS w diagnostyce gruźlicy oraz gruźlicy wielolekoopornej

Na każdych trzy osoby na świecie jedna jest zakażona gruźlicą. Diagnostyka aktywnej gruzlicy zapobiega nowym zakażeniom, ponieważ pacjenci z aktywną postacią tej choroby będą zarażać od 10 do 15 innych osób rocznie aż do momentu wyleczenia lub śmierci. MODS to akronim, którego używamy, aby uniknąć powtarzania sformułowania microscopic observation, drug susceptibility assay; powód nadania takiej nazwy stanie się jasny w miarę wyjaśniania metodologii.

W krótkim filmie przedstawimy metodologię MODS służącą do szybkiej i niedrogiej diagnostyki gruźlicy oraz gruźlicy wielolekoopornej. Film przedstawi metodologię krok po kroku. Omówimy kwestie bezpieczeństwa biologicznego związane z pracą z hodowlami płynnymi, a także wyjaśnimy niektóre z istotnych problemów dotyczących zapewnienia jakości, które są wymagane przy stosowaniu tej metodologii.

Test mods opracowano na Uniwersytecie Kayana w Limie w Peru, w laboratorium Boba Gilmana. Metoda ta powstała w wyniku obserwacji poczynionych pierwotnie przez loose cavi. LOOSE dążył do zidentyfikowania szybkich sposobów wykrywania mycobacterium tuberculosis w hodowlach z wykorzystaniem wskaźników kolorymetrycznych.

Zauważyła jednak, że obserwacja tych kultur pod mikroskopem ujawniła obecność wzrostu mikrobakterii na kilka dni przed zmianą barwy wskaźników kolorymetrycznych i to właśnie na tej obserwacji oparto opracowanie testu MOD. Test MOD został opracowany w warunkach ograniczonych zasobów i jest skierowany do miejsc z ograniczonymi zasobami, kosztując zatem nieco mniej niż 3 jednostki za test w przypadku wykrywania gruźlicy w kulturach płynnych oraz wykrywania lekooporności wielolekowej. Jest to niezwykle atrakcyjne rozwiązanie, które po raz pierwszy wprowadza taką zdolność diagnostyczną do miejsc o ograniczonych zasobach.

Zatem test MODS opiera się na trzech głównych zasadach. Pierwszą z nich jest fakt, że Mycobacterium tuberculosis rośnie w mediach płynnych znacznie szybciej niż w mediach stałych. Jest to fakt znany od wielu lat.

Po drugie, obserwując te podłoża płynne pod mikroskopem, możemy wykryć wzrost M. tuberculosis znacznie szybciej niż czekając na makroskopowe pojawienie się kolonii na podłożach stałych. Co więcej, wzrost ten jest całkowicie charakterystyczny, dzięki czemu możemy odróżnić M. tuberculosis w podłożach płynnych od zanieczyszczeń bakteryjnych lub grzybiczych, a także od wzrostu atypowych prątków niegruźliczych, które mogą być obecne. Wreszcie, i jest to być może najbardziej ekscytująca cecha testu MGIT, polega ona na tym, że możemy wprowadzić leki, takie jak ryfampicyna, i w ten sposób bezpośrednio z plwociny ocenić wielolekową oporność.

Stosując te leki na początku analizy, możemy wykryć gruzlicę oraz jednocześnie ustalić, czy dany izolat jest oporny na te dwa leki. Eliminuje to konieczność przeprowadzania pasażowania i tworzenia pośredniego testu wrażliwości na leki. Teraz przedstawimy sprzęt niezbędny do wykonania analizy MODS.

Do przechowywania przygotowanych pożywek niezbędna jest lodówka. Do odważenia składników oraz Rifampicyny wymagana jest waga. Do mieszania plwociny niezbędny jest wstrząsacz typu vortex.

Do roztworu do dekontaminacji wymagana jest wirówka do zagęszczania zdekontaminowanej próbki plwociny, która musi umożliwiać osiągnięcie 3000 G. Wirówka nie musi być chłodzona, jednak absolutnie niezbędne jest, aby była bezpieczna biologicznie. Praca z prątkami wymaga, aby kosze wirówki mogły być zamykane szczelnymi, blokowanymi pokrywami. Wymagany jest inkubator, który potrafi osiągnąć i utrzymać temperaturę 37 °C.

Nie jest wymagane wzbogacenie w CO2. Do odczytu płytek z modyfikacjami niezbędny jest mikroskop odwrócony z obiektywami 4x i 10x; autoklaw jest potrzebny do sterylizacji mediów oraz do utylizacji kultur mikrobiologicznych, wymagane są pipety automatyczne do odmierzania aliquotów w mediach, a także komora z laminarnym przepływem powietrza klasy II do procedur obejmujących manipulację próbkami plwociny i szczepienie płytek.

Odczynniki wymagane do wykonania analizy mods są następujące: podłoże Middlebrook seven H nine, kazeina i glicerol, Panta, która jest suplementem antybiotykowym oraz OADC, suplement odżywczy. Zapasy antybiotyków to Rifampin, dimetylosulfoksyd (DMSO) do przygotowania ryfampicyny, wodorotlenek sodu, cytrynian sodu oraz N-acetylcysteina do dekontaminacji plwociny, fosforan sodu i fosforan potasu do przygotowania buforu fosforanowego, 10% podchloryn sodu do utylizacji zakażonych odpadów oraz środek dezynfekujący do czyszczenia powierzchni roboczych. Wymagane są również następujące tworzywa i materiały zużywalne: sterylne probówki szklane, filtry 0,2 µm do rozpuszczalników wodnych i filtry 0,2 µm do rozpuszczalników organicznych, probówki do mikrocentryfugi, probówki do centryfugi 15 ml, sterylne pipety serologiczne 50 ml i 10 ml, sterylne końcówki do mikropipet, 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych oraz szczelne worki typu Ziploc, w których umieszcza się płytki 24-dołkowe po zaszczepieniu próbki plwociny w podłożu.

Można wcześniej przygotować cztery grupy roztworów stokowych. Bufor fosforanowy składa się z kombinacji roztworów fosforanu sodu dwuwodornianowego i fosforanu potasu jednowodornianowego, doprowadzonych do pH 6,8 ± 0,2. Roztwór ten jest autoklawowany w temperaturze od 121 do 124 °C przez 15 minut w celu sterylizacji, a następnie jego alikwot jest hodowany na agarze odżywczym w celu potwierdzenia sterylności.

Próbkę można przechowywać w lodówce w temperaturze od 2 do 8 °C przez maksymalnie jeden miesiąc. Każda próbka plwociny wymaga 10 mL roztworu buforu fosforanowego. Roztwór roboczy do dekontaminacji plwociny to kombinacja wodorotlenku sodu i cytrynianu sodu.

Roztwory te łączy się w równych objętościach i autoklawuje w temperaturze od 121 do 124 °C przez 15 minut; mogą być one również przechowywane w lodówce w temperaturze od 2 do 8 °C przez maksymalnie jeden miesiąc. Do każdej próbki plwociny wymagane jest 2 mL tego roztworu. Podstawowa pożywka hodowlana składa się z Middlebrook 7H9 z kazeiną i glicerolem.

Proszek 7H9 rozpuszcza się w sterylnej wodzie destylowanej zawierającej glicerol oraz kazeinę i miesza przy stałym wytrząsaniu aż do całkowitego rozpuszczenia. Pożywkę tę autoklawuje się w temperaturze od 121 do 124 °C przez 15 minut, a po ochłodzeniu rozdziela w ilościach 4,5 ml do sterylnych szklanych probówek o wymiarach 16 × 100 mm. Pożywkę inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w celu weryfikacji sterylności, o której świadczy brak zmętnienia po tym czasie; można ją przechowywać w temperaturze od 2 do 8 °C z szczelnie zamkniętym zakrętką do jednego miesiąca.

Każda próbka plwociny wymaga jednej probówki zawierającej 4,5 milliliters tej pożywki. Roztwory zapasowe antybiotyków są przygotowywane w następujący sposób: rozpuszcza się je całkowicie w sterylnej wodzie destylowanej, a następnie filtruje za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 micrometer dla rozpuszczalników wodnych. Alikwoty 20 microliter można następnie przechowywać w sterylnych probówkach do mikrocentryfugi w temperaturze minus 20 degrees centigrade do sześciu miesięcy; każda alikwota 20 microliter jest wystarczająca dla maksymalnie stu próbek.

Roztwory zapasowe ryfampicyny o stężeniu 8 mg/ml przygotowuje się poprzez rozpuszczenie ryfampicyny w DMSO i sterylnej wodzie destylowanej. Mieszaninę tę filtruje się za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm do rozpuszczalników organicznych, a roztwór można przechowywać w 20 µl alikwotach w sterylnych probówkach do mikrocentryfugi w temperaturze -20 °C przez okres do sześciu miesięcy; każda 20 µl alikwota jest wystarczająca dla maksymalnie 100 próbek. Przechodzimy teraz do właściwej części metodologii i trzech kroków, które należy wykonać w dniu przeprowadzenia procedury.

W tym etapie roztwory zapasowe są przekształcane w roztwory robocze. Najpierw przygotowujemy roztwór do dekontaminacji, następnie roztwór pożywki, a na koniec roztwory robocze leków: izoniazydy i ryfampicyny.

Metoda dekontaminacji stosowana w metodologii mods to zestandaryzowana procedura dekontaminacji N-acetylocysteiny (NALK) z wodorotlenkiem sodu. NALK jest środkiem mukolitycznym, który wspomaga rozrzedzanie plwociny, umożliwiając wodorotlenkowi sodu przeprowadzenie dekontaminacji. W tym celu niezbędny jest roztwór stokowy wodorotlenku sodu i cytrynianu sodu, do 20 ml którego dodaje się 0,1 g NALK.

Wszelkie roztwory, które nie zostaną zużyte w dniu przygotowania, należy utylizować. Ostateczne sporządzenie pożywki powinno być również wykonane wyłącznie w dniu użycia. Przechowywane podłoże 7H9 łączy się z OADC i Panta: do każdej probówki dodaje się 4,5 ml pożywki, 0,5 ml OADC oraz 0,1 ml Panta.

Taka ilość jest wystarczająca dla jednej próbki. Roztwory robocze każdego leku przygotowuje się w dniu użycia, a wszelkie niewykorzystane roztwory należy utylizować, ponieważ nie można zagwarantować aktywności przechowywanych alikwotów. Alikwoty rozcieńcza się seryjnie w 24-dołkowych płytkach hodowlanych za pomocą pożywki 7H9 oh A DC w taki sposób, aby końcowe stężenie w dołku po dodaniu próbki plwociny z pożywką wynosiło 0,4 µg/mL dla kwasu fukarowego i 1 µg/mL dla ryfampicyny.

Przechodzimy teraz do procedury dekontaminacji: 2 ml próbki plwociny umieszcza się w probówce typu Falcon z stożkowym dnem, a następnie dodaje 2 ml roztworu dekontaminującego na bazie wodorotlenku sodu. Nakrętkę zakłada się i mocno dokręca, po czym zawiesinę poddaje się mieszaniu w wstrząsarku typu vortex i pozostawia na 15 minut, podczas których zachodzi proces dekontaminacji. Po upływie tego czasu dodaje się 14 ml roztworu buforu fosforanowego.

Nakrętkę zakłada się i mocno dokręca, a następnie probówkę umieszcza się w wirówce. Po 50 minutach wirowania przy 3000 G supernatant S zostaje odlany, a pozostały osad stanowi próbkę, którą chcemy wysiać, używając 5,1 mililitrowych probówek z siedmiu H dziewięć OEDC panter. Osad resuspensuje się do objętości około dwóch mililitrów. Połowę tej zresuspensowanej próbki przechowuje się jako kopię zapasową w probówce do mikrocentryfugi.

Jest to dostępne na wypadek, gdyby nasza hodowla uległa zanieczyszczeniu i musielibyśmy ponownie wysiać próbkę. Pozostały mililitr dodaje się do pozostałych siedmiu H90 ADC panter w probówce szklanej, co stanowi naszą próbkę gotową do wysiania. 900 µL tej zawiesiny medium i próbki umieszcza się w każdej z czterech studzienek w kolumnie płytki 24-dołkowej.

Pozostałe dołki płytki 24-dołkowej wypełnia się kolejnymi próbkami w taki sposób, aby na jednej płytce znalazło się pięć próbek, po jednej dla każdej z pięciu kolumn, natomiast szósta kolumna pozostaje bez próbki. Szósta kolumna służy jako kontrola negatywna. Do tej kolumny wprowadza się wszystkie składniki pożywki bez próbki plwociny; każdy widoczny wzrost w tej kolumnie wskazuje na problem z zanieczyszczeniem krzyżowym, co wymaga odrzucenia całej płytki.

Każda analizowana płytka wymaga kolumny kontroli negatywnej. Obecnie dysponujemy płytką zawierającą wszystkie próbki oraz pożywkę. Zawiesiny antybiotyków należy dodać na osobnej płytce.

Przygotowaliśmy rozcieńczenia ryfampicyny i isid zgodnie z wcześniejszym opisem. Za pomocą czterokanałowej pipety wielokanałowej pobieramy 100 µL z każdej z tych studzienek, a następnie dozujemy 100 µL medium 7H9 OADC do każdej z dwóch studzienek kontrolnych oraz 100 µL ryfampicyny i 100 µL isid do każdej z dwóch studzienek zawierających leki. Po całkowitym napełnieniu płytki nakładamy pokrywkę i umieszczamy ją w woreczku strunowym Ziploc. Od tego momentu woreczek nie jest już otwierany, dzięki czemu żadne kultury rozwijające się w podłożu płynnym nie mają możliwości wydostania się z woreczka.

Wszystkie kolejne odczyty z płyt wykonuje się wewnątrz worka, który po zakończeniu hodowli zostaje umieszczony w worku autoklawizacyjnym i wyrzucony. W ten sposób unikamy manipulacji przy silnie skoncentrowanych zawiesinach prątków. Teraz omówimy krótko kwestię kontroli jakości.

W metodologii mods wbudowano kontrole jakości, które są niezbędne do prawidłowego przeprowadzenia analizy. Przede wszystkim stosuje się kontrole negatywne, które są wykonywane na każdej płytce. Zostały one wspomniane wcześniej, ale podsumowując, na płytce znajduje się kolumna zawierająca wszystkie składniki pożywki bez próbki plwociny, obok pięciu innych próbek plwociny; studzienki w tej kolumnie należy badać tak samo jak wszystkie pozostałe, a stwierdzenie jakiegokolwiek wzrostu w tych studzienkach świadczy o wystąpieniu zanieczyszczenia krzyżowego, co oznacza, że żadnemu z wyników na danej płytce nie można zaufać.

W związku z tym płytkę należy odrzucić, a wszystkie próbki należy ponownie nanieść na nową płytkę. Dodatkowo stosuje się kontrole wewnętrzne, które są kontrolami pozytywnymi. Są one przeprowadzane na oddzielnej płytce, którą przygotowuje się po przygotowaniu wszystkich pozostałych płytek z próbkami pod koniec dnia, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji krzyżowej w laboratorium.

Na tej oddzielnej płytce wysiewamy jeden w pełni wrażliwy szczep Mycobacterium tuberculosis oraz szczep oporny na isoniazyd i ryfampicynę. Jeśli istnieją obawy dotyczące prowadzenia hodowli szczepu wielolekoopornego na płytce, zamiast tych dwóch szczepów (wrażliwego i MDR) można zastosować szczepy oporne odpowiednio tylko na ryfampicynę i tylko na isoniazyd. Celem zastosowania tych szczepów jest wykazanie nie tylko tego, że podłoża wspomagają wzrost – w związku z czym wszystkie nasze kontrole pozytywne powinny wykazać wzrost w dołkach bez leków – ale także że stężenia leków są prawidłowe; w konsekwencji wrażliwe kontrole pozytywne nie powinny rosnąć w obecności isoniazydy i ryfampicyny, natomiast oporne kontrole pozytywne powinny oczywiście rosnąć przy stężeniach ryfampicyny i isoniazydy obecnych na płytce.

Przechodzimy teraz do odczytu płytek. Jeśli przyjmiemy, że dzień wysiewu naszych próbek to dzień zero, to odczyt płytek rozpoczyna się w piątym dniu. Przed tym terminem wzrost prątków występuje bardzo rzadko.

Płytki bada się pod odwróconym mikroskopem świetlnym. Oznacza to, że płytki są oglądane od dołu ku górze, co pozwala na bardzo wyraźne zobaczenie sznurów; próby wizualizacji kultur od góry są utrudnione przez kondensację pary wodnej na pokrywach płytek, a także z powodu niewystarczającej ogniskowej standardowego mikroskopu. Badanie mikroskopowe przeprowadza się zazwyczaj z użyciem obiektywu 10x; za kultury dodatnie uznaje się te, w których w obu studzienkach wolnych od leku znajduje się co najmniej dwie jednostki tworzące kolonie.

Obecność zanieczyszczeń jest łatwo rozpoznawalna, ponieważ pożywka staje się mętna, a do piątego dnia zazwyczaj dochodzi do przerośnięcia większości studzienki. W przeciwieństwie do tego, wzrost prątków nie prowadzi do zmętnienia studzienki; początkowy wzrost prątków tworzy małe formy przypominające przecinki, które stopniowo przekształcają się w charakterystyczne sznury lub sploty. W ciągu dwóch tygodni w przypadku silnie dodatniego wzrostu powstaną konglomeraty prątków, w których sznury są widoczne jedynie na obrzeżach.

Zdecydowana większość kultur, które wykażą wzrost, stanie się dodatnia do 14. dnia, dlatego zalecamy codzienne odczyty od piątego do 14. dnia, a następnie odczyty co dwa lub trzy dni, zależnie od obciążenia pracą laboratorium. W dniu, w którym kultura w dwóch studzienkach bez leków jest wyraźnie dodatnia, należy odczytać studzienki zawierające leki. Wszelki wzrost w obecności któregokolwiek z leków wskazuje na oporność na ten lek. Należy pamiętać, że jeśli odczyt studniczek zawierających leki zostanie wykonany ponad tydzień po odnotowaniu dodatniej kultury w studzienkach bez leków, może to nie oznaczać oporności, ponieważ sporadycznie obserwuje się wzrost przełamujący.

Odczyty można przerwać w 21. dniu, jeśli posiew jest ujemny, ponieważ w przypadku pacjentów niepoddawanych terapii nigdy nie stwierdzono posiewów dodatnich po tym czasie. Po upływie 21 dni inkubacji posiewy można zutylizować. Posiewy pozostają w workach Ziploc, które następnie umieszcza się w workach do autoklawowania i autoklawuje w temperaturze od 121 do 124°C przez 45 do 60 minut, po czym można je bezpiecznie wyrzucić. Chciałbym teraz powiedzieć kilka słów o bezpieczeństwie biologicznym i teście MODS, ponieważ wdrażaliśmy MODS nie tylko w Peru, ale także w ośrodkach w Afryce i Azji.

Często pojawia się pytanie dotyczące bezpieczeństwa i bioasekuracji przy stosowaniu kultur prątków w podłożach płynnych. Jest to zrozumiały obaw, ponieważ płyny mogą zostać rozlane, czego nie dzieje się w przypadku podłoży stałych, a ponadto istnieje ryzyko aerozolizacji podczas pracy z zawiesinami prątków. To właśnie z tych powodów uważamy, że metodologia mod jest bezpieczniejsza niż jakakolwiek metoda wymagająca pośredniego badania wrażliwości na leki.

Dzieje się tak dlatego, że w przypadku pośredniego badania wrażliwości przygotowuje się zawiesinę mikroorganizmów o znanym stężeniu. Wiąże się to zatem z manipulowaniem silnie skoncentrowanymi roztworami mikroorganizmów, co niesie ze sobą ryzyko rozlania i aerozolizacji. W przeciwieństwie do tego, metodologia mods, z którą zapoznali się Państwo przed chwilą, polega po prostu na inokulacji próbki plwociny do naszej płytki, po czym płytka zostaje zamknięta w plastikowej torebce.

Torebka ta nie jest już ponownie otwierana, dzięki czemu nie musimy mieć kontaktu z tymi silnie skoncentrowanymi zawiesinami. Nie oznacza to, że uważamy metodę mod za całkowicie bezpieczną – manipulowanie prątkami zawsze wiąże się z ryzykiem. Jednak dane z Korei opublikowane w 2006 roku zdawały się potwierdzić nasze stanowisko, że metoda mod nie jest bardziej niebezpieczna niż wysiewanie jakiejkolwiek innej hodowli.

Przeprowadzono badanie wśród pracowników laboratorium, które wykazało, że ryzyko zawodowe u osób zajmujących się wysiewaniem kultur i niebędących odpowiedzialnymi za badania podatności na leki nie było większe niż w przypadku osób wykonujących mikroskopię plwociny. W przeciwieństwie do nich, osoby obchodzące się z zawiesinami prątków i wykonujące badania podatności na leki wykazują znacznie wyższy poziom ryzyka zawodowego zachorowania na gruźlicę. Oczywiście najwyższej wagi jest to, aby cały personel laboratoryjny był chroniony w możliwie największym stopniu, dlatego stanowczo zalecamy, aby żadna z tych procedur nie była przeprowadzana bez odpowiednich środków ochrony dróg oddechowych, przez które rozumiemy maski w standardzie N95.

Dodatkowo wymagana jest komora z laminarnym przepływem powietrza lub dygestorium klasy drugiej, w której wszystkie obszary wywiewne są filtrowane przez filtry HEPA. Wreszcie, prostym, lecz bardzo istotnym mechanizmem pozwalającym uniknąć turbulencji przepływu powietrza w laboratorium, jest zamek w drzwiach laboratoryjnych, który zapobiega wchodzeniu i wychodzeniu personelu podczas przetwarzania próbek. Ogranicza to ryzyko transmisji wewnątrz laboratorium. Mam nadzieję, że dostarczyło to Państwu dobrego przeglądu metodologii MODS oraz informacji, jak przydatna może być ona w warunkach ograniczonych zasobów, gdzie pilnie wymagana jest wysokiej jakości diagnostyka TB i MDR TB.

Aby uzyskać więcej informacji, można odwiedzić naszą stronę internetową mods peru. org, gdzie znajdują się szczegółowe standardowe procedury operacyjne oraz przewodnik użytkownika systemu mods. Oprócz SOP dotyczących przetwarzania próbek pozapłucnych, udostępniamy również bibliotekę zdjęć prątków gruźlicy, innych prątków oraz zanieczyszczeń bakteryjnych i grzybiczych, a także naszą strategię zapewnienia jakości i procedurę rekomendowaną w celu akredytacji laboratoriów rozpoczynających korzystanie z mods.

Na koniec udostępniamy arkusz z najczęściej zadawanymi pytaniami i zapraszamy do przesyłania wszelkich uwag od użytkowników korzystających obecnie z modyfikacji, ponieważ jest to metodologia iteracyjna. Jak wyjaśniliśmy wcześniej, jest to test niewłasnościowy i jesteśmy zawsze zainteresowani ulepszeniami, które udało się wprowadzić innym laboratoriom.