A avaliação quantitativa do Lipidome fermento usando Electrospray Espectrometria de Massa de Ionização

Este protocolo permite analisar rapidamente os principais componentes dos lipídios de levedura. Ele começa com a colheita e lavagem de células de levedura. Células lavadas são colocadas em uma mistura de clorofórmio e metanol na proporção de um para dois e lisadas com esferas de vidro.

A adição de clorofórmio e água separa as duas fases. A fase orgânica é coletada, seca, e o filme lipídico é então dissolvido em clorofórmio para armazenamento antes da espectrometria de massa. Os lipídios extraídos são diluídos em clorofórmio e metanol com hidróxido de amônio, e uma mistura de padrões internos é adicionada.

A solução lipídica pode agora ser injetada diretamente no espectrômetro de massas. Olá, sou Simon Bork do laboratório de Vladimir Teco, do Departamento de Biologia da Universidade Concordia. Hoje vou mostrar um método para quantificar lipídios de levedura utilizando espectrometria de massas.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar alterações nos lipídios de levedura sob diferentes condições de crescimento. Então, vamos começar. Para iniciar este procedimento, ressuspenda os pellets de levedura previamente preparados congelados em 1,6 mililitros de água destilada gelada e transfira 1,6 mililitros da suspensão celular para tubos de centrífuga de vidro de alta velocidade.

Observe que, durante todo este procedimento, todas as manipulações com lipídios extraídos são realizadas usando pipetas ou seringas de vidro. Como plásticos gerarão um sinal de fundo elevado se entrarem em contato com clorofórmio, inicie a extração de lipídios adicionando seis mililitros de uma mistura de clorofórmio e metanol na proporção de um para dois e 0,8 mililitros de esferas de vidro medidos em um tubo einor à suspensão celular. Os volumes exatos não são críticos, desde que a proporção de um para dois para 0,8 entre clorofórmio, metanol e levedura suspensa em água seja mantida. Vortex.

A suspensão celular e as perlas de vidro são misturadas duas vezes, por um minuto cada vez; em seguida, adicione dois mililitros de clorofórmio e misture suavemente, depois incube por cinco minutos à temperatura ambiente com mistura ocasional. Após a incubação de cinco minutos, adicione dois mililitros de água destilada e misture suavemente. Em seguida, incube novamente por cinco minutos à temperatura ambiente com mistura ocasional.

Aqui também, é mais importante manter a proporção de dois para dois para 1,8 de clorofórmio, metanol e água do que um volume específico. Quando a segunda incubação estiver concluída, centrifugue por cinco minutos a 3000 Gs em temperatura ambiente, colete todo o sobrenadante dessa primeira extração em um novo tubo de centrífuga de vidro de alta velocidade e adicione 3,2 mililitros de clorofórmio aos pellets celulares remanescentes para uma segunda extração de lipídios.

Vortexar os pellets celulares com o clorofórmio adicionado duas vezes, por um minuto cada vez. Em seguida, centrifugar por cinco minutos a 3000 Gs à temperatura ambiente; adicione o sobrenadante dessa segunda extração ao sobrenadante coletado após a primeira extração. Em seguida, centrifugue os sobrenadantes coletados por cinco minutos.

A 3000 Gs e temperatura ambiente, os lipídios extraídos estão agora dissolvidos na fase orgânica inferior. Descarte a fase aquosa superior e transfira a fase inferior para um novo tubo de centrífuga de vidro de alta velocidade. Para obter espectros mais limpos no centrífugo do espectrômetro de massas, centrifugue a fase orgânica por cinco minutos a 3000 Gs e temperatura ambiente e transfira todo o sobrenadante para um frasco de vidro.

Seque os lipídios dissolvidos sob atmosfera de nitrogênio, dissolva o filme lipídico seco em 500 microlitros de clorofórmio e armazene a menos 20 graus Celsius até o momento de analisar as amostras por espectrometria de massas. Comece preparando uma mistura padrão dos lipídios em clorofórmio conforme listado na tabela um do protocolo escrito anexo. Cada lipídio representa uma classe diferente.

Esta solução pode ser armazenada a menos 20 graus Celsius para uso posterior antes da injeção dos lipídios extraídos no espectrômetro de massas. Combine 10 microlitros da amostra com 10 microlitros da mistura padrão de lipídios. Observe que a proporção entre padrão e amostra pode ser alterada conforme necessário.

Resolva a amostra e a mistura de lipídios padrão utilizando um espectrômetro de massas micro Q-to-F, equipado com uma fonte de nanoionização por eletrospray operando em uma taxa de fluxo de um microlitro por minuto. As configurações estão detalhadas na tabela dois do protocolo escrito anexo. Embora o uso da alta resolução de um espectrômetro de massas Q-to-F seja vantajoso, não é um requisito obrigatório.

Os parâmetros exatos do instrumento variam entre espectrômetros de massa. Após a aquisição dos dados, os espectros de massa são suavizados, o fundo é subtraído e os picos são centralizados. Por fim, exporte a lista de picos para o Excel.

Em seguida, normalize os picos de cada vidro lipídico em relação ao seu padrão interno. Dependendo da aplicação, pode ser necessário realizar um processamento adicional, como desisotopização e desconvolução. Este método permite a determinação rápida e detalhada dos principais componentes do lipoma de levedura.

Aqui destacamos um lipídio que foi desconvoluido por desisotopia e normalizado ao seu padrão interno. Acabamos de mostrar como isolar lipídios de levedura e como determinar o lipídio de levedura utilizando espectrometria de massas com ionização por eletrosspray. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de evitar o uso de plásticos e manter sua amostra na faixa linear de concentrações.

Este método é bastante flexível e muitos dos volumes podem ser alterados conforme necessário. Este protocolo de extração também é adequado para outros métodos de análise de lipídios, como cromatografia em camada delgada e espectroscopia de massas multidimensional. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.