Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

Olá, meu nome é Brad Hamilton. Sou cientista no departamento de Pesquisa e Desenvolvimento da STEM Gen. Hoje mostraremos um procedimento para reprogramar fibroblastos humanos utilizando fatores de reprogramação entregues por lentivírus.

Este procedimento pode ser utilizado tanto para gerar células iPS quanto para estudar o processo de reprogramação. As células iPS são semelhantes às células ES na morfologia, proliferação e capacidade de diferenciação em todos os tipos de tecidos do corpo. As células iPS humanas apresentam uma vantagem distinta em relação às células ES, pois exibem propriedades-chave das células ES sem o dilema ético de destruir um embrião para obter as células.

A geração de células IPS específicas do paciente contorna um obstáculo importante para terapias de medicina regenerativa personalizada, eliminando o risco de rejeição imunológica de células transplantadas não autólogas. Então, vamos começar. Em diversos momentos deste protocolo, você substitui o meio de cultura das células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC) em desenvolvimento por meio condicionado com metilcelulose.

Preparar este meio leva seis dias. Portanto, comece pelo menos uma semana antes de iniciar seu experimento. Para começar, semeie cada poço de uma placa de seis.

Placa de poços com duas vezes 10 elevado à quinta cfu de células alimentadoras de met em dois mililitros de meio de crescimento para met. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, substituir o meio por cultura de células humanas E-S-I-P-S.

Incubar o meio durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Coletar o sobrenadante e substituir por meio fresco a cada 24 horas durante quatro dias. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 micrômetro.

Suplemente o sobrenadante coletado com 15 nanogramas por mililitro de fator de crescimento de fibroblastos básico (BFGF). Você terá cerca de 16 mililitros de meio condicionado por met, armazenando o sobrenadante coletado a cada dia separadamente a quatro graus Celsius. O meio condicionado por met pode ser armazenado por uma a duas semanas a quatro graus Celsius ou por vários meses a menos 20 graus Celsius.

Agora que você garantiu que o meio condicionado com metionina estará pronto quando necessário, vamos falar sobre o preparo das células. A primeira tarefa na geração de iPSCs é usar lentivírus para transduzir células de fibroblastos da pele humana ou células BJ com quatro fatores de transcrição característicos de células-tronco. Para se preparar para a transdução, semeie as células BJ numa densidade de um vezes 10 à quinta células por poço de uma placa de seis poços e cultive.

As células em dois mililitros de meio de crescimento, incubadas durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no mesmo dia. Comece a preparar as placas com alimentadores de metotrexato adicionando dois mililitros de gelatina a 0,1% diluída em água a uma placa de seis poços e incubando durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. A gelatina reveste os poços e serve como uma matriz para as células.

Agora as células BJ estão prontas para a transdução lentiviral para preparar o vírus para a transdução. Suplemente dois mililitros de meio fresco com seis microgramas por mililitro de polibrena e quatro lentivírus, cada um expressando um dos fatores de transcrição humanos T4, SO2, nanog e lin28, de modo que cada um tenha a mesma multiplicidade de infecção ou MOI.

Esses lentivírus estão todos incluídos no conjunto de lentivírus de fatores de reprogramação humanos. Para realizar a transdução, basta substituir o meio de crescimento das células BJ pelo meio contendo o vírus. Agite suavemente a placa para que o meio recubra uniformemente o fundo.

Incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no mesmo dia. Retirar um frasco de células alimentadoras de cf one meth do nitrogênio líquido e descongelar. Remover a solução de gelatina das placas de células alimentadoras de met, que agora estão revestidas com gelatina cada uma.

Adicionaremos 0,2 vezes 10 à quinta células em dois mililitros de meio de crescimento para MET. Incubar as MET durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, destacar as células BJ com tripsina 0,05% EDTA e centrifugar a 200 Gs durante cinco minutos.

Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e re-suspenda as células no meio de crescimento. Remova o meio do poço alimentador de metionina e adicione dois mililitros por poço da suspensão de células BJ. A concentração de células BJ deve ser aproximadamente cinco vezes 10 à quarta células por poço.

Incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. 24 horas após o recuo das células BJ na placa com alimentador de metionina, substituir o meio por E-S-I-P-S humano, que é meio de cultura de células-tronco embrionárias ou células-tronco pluripotentes induzidas. Continuar a trocar o meio a cada 24 horas durante sete dias.

No sétimo dia, substitua o meio de cultura de células ES por dois mililitros de meio condicionado por metófilo. As células alimentadoras de metófilo têm fornecido os fatores solúveis necessários para o crescimento de células IPS. Mas agora precisamos adicionar mais desses fatores para manter a cultura saudável.

O meio condicionado por metano contém todos os fatores solúveis secretados pelas células alimentadoras de metano incubadas durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Observando pelo microscópio, selecione uma colônia celular. Distinguida por uma aparência compacta e arredondada em uma placa fresca de 24 poços que você previamente preparou 24 horas antes com células alimentadoras de metano ccf um, recolha a colônia selecionada na cultura humana E-S-I-P-S.

Meio suplementado com 10 micromolares da molécula-tronco Y 2 7 6 3 2, um inibidor de quinase dependente. Troque o meio de cultura sem suplementar com a molécula-tronco Y 2 7 6 3 2 a cada 24 horas durante os primeiros sete dias.

Após sete dias, troque o meio para met. Condicione ao meio e continue a repicar as células até que apresentem a morfologia típica de células-tronco embrionárias humanas. Observe colônias pequenas, compactas e com formato de cúpula, que possuam bordas nítidas.

As colônias devem ser uniformes e apresentar uma alta relação entre núcleo e citoplasma. Neste ponto, você desenvolveu colônias com a morfologia de células-tronco embrionárias (ES), mas elas também expressam genes característicos dessas células? Para descobrir, realize a coloração das colônias para marcadores de pluripotência, como TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-3, SSEA-4, SSEA-1, Sox2, Nanog e T. Para começar, lave suavemente as células três vezes com PBS.

Em seguida, fixe as células com 500 microlitros de paraformaldeído a 4% ou outro fixador por 20 minutos à temperatura ambiente. Após 20 minutos, lave as células com PBS por 3 vezes para remover o fixador em excesso. Em seguida, bloquee a ligação inespecífica incubando as células em 500 microlitros de tampão bloqueador por poço durante uma hora à temperatura ambiente. Após a etapa de bloqueio, adicione 250 microlitros de anticorpo primário diluído na proporção de 1:100 no tampão bloqueador para cada poço.

Incube bem as células com o anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lave as células três vezes com PBS para remover o anticorpo primário não ligado. Incube as células com 250 microlitros de anticorpo secundário diluído na proporção de um para 300 em tampão bloqueador por uma hora à temperatura ambiente, mantendo ao abrigo da luz para evitar fotodegradação após a incubação com o anticorpo secundário.

Lave as células três vezes com PBS até a terceira lavagem. Adicione DPI a um micrograma por mililitro para corar os núcleos. Por fim, analise a expressão gênica de suas células IPS.

Sob o microscópio, os resultados de morfologia mostraram quatro células de fibroblastos da pele humana que foram cotransduzidas com T4, SOX2, Nanog e Lin28, nas quais alterações morfológicas foram observadas já no quarto dia após a transdução, e os aglomerados celulares tornaram-se mais compactos no 17º dia. Para caracterizar ainda mais as colônias de células iPS isoladas, investigamos a presença de marcadores comuns de pluripotência expressos em células ES. As colônias exibiram forte atividade de fosfatase alcalina.

Além disso, foi realizada imunoquímica ou ICC nas colônias de células IPS com um painel de anticorpos específicos para marcadores de pluripotência, incluindo os marcadores de superfície TA 180, TRA-1-60, SSEA-4 e SSEA-3, bem como os marcadores nucleares Oct4, SOX2 e Nanog. As colônias isoladas de IPS foram positivas para todos os marcadores. Os resultados da ICC mostram que as células IPS exibiram o padrão apropriado de expressão dos marcadores de pluripotência, demonstrando que essas células IPS se assemelham estreitamente às células-tronco embrionárias humanas indiferenciadas.

Acabamos de mostrar como gerar células iPS por meio da reprogramação de fibroblastos humanos com o conjunto de lentivírus dos genes de células-tronco. Ao realizar este procedimento, é importante levar em consideração diversos fatores.

Primeiro, a proporção entre vírus ativo e alvo pode precisar ser modificada durante a etapa primária de transdução para atingir eficiência ótima de transdução. Segundo, a condição de crescimento das células-alvo pode ter impacto. Células saudáveis e proliferativas são mais suscetíveis à reprogramação.

Terceiro, ao modificar o protocolo para diferentes números de células, recomenda-se que os números-alvo de células sejam ajustados proporcionalmente à área superficial da placa de cultura. Por fim, deve-se considerar a aplicação de inibidores de ROCK, como Y 2 7 6 3 2, para ajudar a garantir um reprogramamento bem-sucedido, já que estudos recentes demonstraram sua utilidade em melhorar a sobrevivência de colônias humanas de tipo yes. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.