Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

O objetivo geral deste procedimento é gerar células IPS humanas por meio da superexpressão mediada por retrovírus de OCT4, SOX2, KLF4 e c-Myc, utilizando um sistema repórter GFP. Isso é realizado primeiramente adicionando a quantidade apropriada de retrovírus individuais que expressam GFP. Em seguida, as células infectadas com o vírus que expressa GFP são transferidas para placas revestidas com gelatina 0,1% contendo fibroblastos embrionários de camundongo.

O terceiro passo do procedimento é substituir o meio por meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas. Por fim, colônias de IPS com silenciamento de GFP que apresentam morfologia semelhante à das células-tronco embrionárias humanas são isoladas. Em última análise, os resultados demonstram a expressão de marcadores pluripotentes endógenos por meio de coloração por imunofluorescência e R-T-Q-P-C-R.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a coloração vital com marcadores de superfície pluripotentes e a observação de alterações morfológicas, é o iPad desejável. As colônias celulares podem ser facilmente isoladas utilizando a perda da expressão de GFP como marcador para as células pluripotentes para iniciar o cultivo. Plaque um vezes 10 à quinta fibroblastos humanos em um poço de uma placa de seis poços em meio para fibroblastos um dia antes da infecção. No dia seguinte, aspire o meio para remover as células mortas e adicione dois mililitros de meio fresco para fibroblastos contendo cinco microgramas por mililitro de sulfato de protamina.

Em seguida, adicione cuidadosamente a quantidade apropriada de cada vírus que expressa GFP, correspondente a uma multiplicidade de infecção de cinco. Incube as células a 37 graus Celsius durante a noite, um dia após a infecção. Remova o sobrenadante viral e lave três vezes com dois mililitros de PBS.

Em seguida, adicione dois mililitros de meio para fibroblastos três dias após a infecção. Verifique a fluorescência de GFP e reponha o poço com dois mililitros de meio para fibroblastos no dia seguinte. Plaque uma vez 10 à quarta por centímetro quadrado de fibroblastos embrionários de camundongo irradiados ou células alimentadoras metiladas em meio para fibroblastos sobre uma placa de Petri de 10 centímetros revestida com gelatina 0,1%.

Incube as células a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, desprenda os fibroblastos humanos infectados com um mililitro de tripsina-EDTA 0,05% durante cinco minutos a 37 graus Celsius e centrifugue durante cinco minutos a 200 ×g. Resuspenda as células em 10 mililitros de meio para fibroblastos e replique as células em placa pré-revestida com gelatina 0,1% com mfs. 24 horas depois.

Substitua o meio por meio de cultura de HESC e troque o meio diariamente. Colônias semelhantes a ESC começarão a aparecer entre 20 e 27 dias após a infecção, após a visualização de colônias semelhantes a ESC em microscópio de fluorescência. Verifique a ausência de fluorescência GFP em uma colônia que apresente morfologia semelhante à de HSCs.

Usando uma pipeta de 10 microlitros, selecione colônias individuais de IPSC e coloque-as em um poço de uma placa de 12 poços revestida com gelatina e metano, suplementada com meio HESC. Troque o meio diariamente e subcultive as células lavando a placa com um mililitro de DMM F 12.

Em seguida, adicione 0,5 mililitro de colagenase e incube por 10 minutos a 37 graus Celsius. Lave as células duas vezes com DM A MF 12. A seguir, adicione dois mililitros de meio fresco para HESC.

Em seguida, utilize um espátula celular para fragmentar as colônias em pequenos pedaços e destacar as células remanescentes da placa. Transfira os fragmentos re-suspensos das colônias para um poço de uma placa de seis poços revestida com gelatina e com MEF e incube a 37 graus Celsius por dois dias.

Para analisar as células por imunofluorescência, lave-as três vezes com PBS e fixe-as com paraformaldeído 4% por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave suavemente as células três vezes com PBS e permeabilize-as com Triton X-100 0,2% em PBS por 30 minutos.

Bloqueie a ligação não específica incubando as células com BSA 3% em PBS por duas horas. Em seguida, incube as células com o anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius. Lave então as células três vezes com PBS e incube-as com o anticorpo secundário por uma hora à temperatura ambiente no escuro.

Lave as células três vezes com PBS durante a última lavagem. Adicione dappy e incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Obtenha imagens das células utilizando um microscópio fluorescente para quantificação em tempo real.

PCR isole o RNA total de IPCs humanos derivados de fibroblastos humanos. Utilizando um kit de isolamento de RNA. Sintetize a fita complementar de cDNA usando a transcriptase reversa.

Em seguida, utilize-o como molde para QPCR para detectar genes de pluripotência. Fibroblastos humanos, BJ, que foram infectados com um coquetel de retrovírus carregando OCT4, SOX2, KLF4 e c-Myc, mostram aqui as alterações morfológicas observadas durante o reprogramamento a partir do dia 5. Nos dias 10, 14 e 21, as células começam a exibir morfologia semelhante à de HESC após 21 dias, e as CIPs são identificadas pela fluorescência de GFP.

Células-tronco pluripotentes, como ESCs e IPCs, expressam a maquinaria molecular necessária para reprimir a expressão gênica proviral. No entanto, os vetores retrovirais utilizados aqui expressam GFP juntamente com genes de reprogramação por meio do LTR retroviral. Assim, células que expressam continuamente GFP são consideradas como expressando transgenes sem silenciamento gênico proviral, conforme observado fielmente aqui: colônias de iPSCs reprogramadas que adquirem a Rede Molecular de Pluripotência apresentam ausência de expressão de GFP.

Esta figura mostra a análise de imuno-histoquímica de colônias derivadas de fibroblastos Detroit 5 51 com anticorpos contra TRA 180 1, TRA one 60 SSEA four T four e nano, conforme pode ser observado com sucesso. As CIPs reprogramadas expressam todos esses marcadores. Além disso, foi realizada R-T-P-C-R quantitativa para analisar a expressão gênica, revelando que T four SOX two, KLF four M e nano foram significativamente aumentados em comparação com as células fibroblásticas parentais, mas compatíveis com os de H nine HSCs.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como infectar o vírus, identificar e coletar as células IPA totalmente programadas com lipídios usando microscopia fluorescente.