Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado
20 de fevereiro de 2012
Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.
Neste artigo em vídeo, fibroblastos humanos adultos são reprogramados para gerar células-tronco pluripotentes utilizando vetores retrovirais. Primeiro, fibroblastos humanos são transduzidos com vetores retrovirais que codificam os fatores de transcrição T three four, SOX two, KLF four e cmic.
Os fibroblastos infectados são cultivados em células alimentadoras embrionárias de camundongo por 14 a 28 dias. Os cultivos resultantes são corados com o anticorpo TRA 180 1 para identificar colônias de células reprogramadas. As colônias positivas são então transferidas para placas contendo MEF para expansão.
A coloração imunocitoquímica confirma a expressão de marcadores de pluripotência e o estabelecimento de linhagens de células-tronco pluripotentes. Estudos adicionais devem então ser realizados para caracterizar mais amplamente as linhagens. Geralmente, indivíduos novos na reprogramação de células somáticas e no cultivo de células-tronco pluripotentes induzidas humanas terão dificuldades, pois é difícil identificar as colônias corretas de iPSCs.
Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Sula Pollak, pesquisadora pós-doutora do meu laboratório. Inicie este procedimento semeando células Phoenix AM FO com uma densidade de cerca de sete a oito milhões de células por placa de 10 centímetros em 10 mililitros de DMEM com alta concentração de glicose, coloque na incubadora e cultive durante a noite. No dia seguinte, prepare misturas de transfeção contendo 12 microgramas de um vetor que codifica T three four SOX, dois klf, quatro cmic ou o gene GFP e 35 microlitros de few gene six em um volume total de 500 microlitros de DMEM com alta concentração de glicose sem soro e com L-glutamina.
Incube as misturas por 20 minutos. Em seguida, para transfectar as células phoenix, pipete delicadamente os complexos de DNA nas placas contendo as células phoenix, que devem estar com 70 a 80% de confluência. Incube as células a 37 graus centígrados após seis a oito horas.
Aspire o meio e substitua-o por oito mililitros de DMEM com alta concentração de glicose e antibióticos. Em seguida, retorne as placas ao incubador por 12 horas após a incubação. Utilize uma pipeta para aspirar e coletar o meio contendo o vírus.
Em seguida, substitua o meio e repita este processo a cada 12 horas até que o meio tenha sido coletado quatro vezes. Armazene o meio a quatro graus centígrados. Após coletar todo o meio, reúna todas as porções e, então, despeje-o através de um filtro de membrana de 0,45 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros para remover células destacadas e debris.
O meio filtrado, que contém partículas virais, pode ser mantido na geladeira por duas semanas sem perder a atividade infecciosa. A congelação não é recomendada. No dia anterior ao procedimento de transdução, descongele o estoque congelado de fibroblastos humanos adultos e adicione uma vez 10 à quinta células por cada poço de placas de seis poços revestidas com gelatina.
No dia seguinte, em um tubo cônico de 50 mililitros, combine 3,5 mililitros de cada meio viral T four SOX two, klf four e cmic, e adicione polibrena a uma concentração final de seis microgramas por litro como controle. Prepare um mililitro de meio viral GFP, três mililitros de meio de cultura e polibrena a uma concentração final de seis microgramas por mililitro. Aspire o meio da placa contendo fibroblastos humanos.
Em seguida, adicione quatro mililitros do meio viral misto ou do meio controle e centrifugue as placas a 1600 ×g durante uma hora a 20 °C. Após a centrifugação, incube as placas por aproximadamente 12 horas. Então, substitua o meio viral por meio de cultura de fibroblastos e incube por mais 12 horas.
Repita este processo da infecção até o cultivo em meio para fibroblastos, mais duas vezes após a última infecção. Cultive os fibroblastos em DMEM por 48 horas. Em seguida, verifique a eficiência da infecção das transduções paralelas com o meio retroviral GFP.
Em seguida, inicie o reprogramamento de células somáticas para células pluripotentes. Os fibroblastos infectados são cultivados em meio de células-tronco embrionárias humanas ou meio HES, semeando fibroblastos embrionários de camundongo, ou MEFs, numa densidade de aproximadamente duas vezes 10 à quinta células por poço de uma placa de seis poços tratada com gelatina, no dia seguinte, em meio de crescimento para fibroblastos.
Divida os fibroblastos humanos infectados usando tripsina-EDTA a 0,05% e semeie-os na densidade de aproximadamente 1,2 vezes 10 à quarta por poço no meio de crescimento de fibroblastos. No dia seguinte, substitua o meio por meio HES contendo butirato de sódio 0,5 milimolar durante os primeiros sete dias do reprogramamento.
Substitua o meio diariamente. Troque os meios por meio HES sem butirato de sódio e continue a reprogramação por mais sete a 21 dias. Troque o meio diariamente a cada dia.
Verifique as células transduzidas quanto a alterações morfológicas. Colônias de células começarão a surgir aproximadamente 10 dias após a transferência dos fibroblastos transduzidos para as células alimentadoras. As colônias contendo as células reprogramadas são agora denominadas células-tronco pluripotentes induzidas humanas ou células iPS humanas.
As colônias de células iPS humanas estarão prontas para serem isoladas entre 14 e 28 dias após o plaqueamento em células alimentadoras MEF. Nesta fase, as colônias de células iPS humanas podem ser transferidas para placas contendo MEF ou revestidas com matrigel. O transferência para placas contendo MEF é demonstrada um dia antes da seleção das colônias de células iPS humanas: semeie placas de 24 poços contendo células alimentadoras MEF irradiadas por gama em meio de crescimento de fibroblastos.
Incubar a 37 graus Celsius com 5% de CO2 no dia em que as colônias de células IPS humanas serão selecionadas. Aspirar o meio de crescimento de fibroblastos dos ME Fs e lavá-los com PBS para remover quaisquer vestígios de soro bovino fetal. Em seguida, adicionar 0,5 mililitros de meio de célula-tronco embrionária humana ou meio HES contendo 10 micromolares de inibidor de ROCK Y 2 7 6 3 2 a cada poço. Depois, utilizando um microscópio montado em uma câmara de fluxo laminar, examinar as placas de reprogramação quanto à formação de colônias de células IPS humanas.
Se necessário, remova os fibroblastos ao redor das colônias de células IPS humanas com uma agulha de 21 graus. Enxágue as placas com PBS e adicione meio HES fresco contendo o anticorpo específico vivo TRA 180 1. Retorne as células ao incubador a 37 graus centígrados com 5% de CO2.
Após 30 minutos, substitua o meio por meio HES fresco suplementado com inibidor de rock a 10 micromolar. Em seguida, visualize as colônias ao microscópio fluorescente. Marque as colônias positivas para TRA-1-81.
Usando uma marcação objetiva com uma agulha de 21 gauge, corte as colônias de células IPS humanas positivas para TRA 180 1 em vários pedaços pequenos. Em seguida, utilizando uma pipeta automática, transfira fragmentos das colônias de células IPS humanas para poços individuais de uma placa de 24 poços contendo ME Fs. Evite transferir células não IPS.
Coloque as placas no incubador e deixe as colônias de células iPS humanas aderirem por 24 a 36 horas, trocando o meio diariamente. As colônias de células iPS humanas com morfologia correta semelhante à de HE serão visíveis 48 horas após a transferência inicial para uma placa de 24 poços. Passe manualmente as colônias de células iPS humanas a cada seis a oito dias, cortando-as com uma agulha de calibre 21. Expanda os cultivos para uma placa de 12 poços e, posteriormente, para uma placa de seis poços após a expansão clonal.
E ao estabelecer linhagens celulares de IPS humanas, analisar a expressão dos marcadores de pluripotência TRA-1-60, SSEA-4, TRA-1-81, SOX2 e Nanog utilizando imunoquímica, uma vez que as linhagens tenham sido estabelecidas. A caracterização detalhada pode incluir diferenciação in vitro e in vivo, análise de cariótipo, análise de silenciamento de transgenes, estudos de metilação e estudos de expressão gênica.
A transdução eficiente com meio contendo retrovírus é fundamental para um reprogramamento bem-sucedido, a fim de determinar a eficácia da transdução viral. Fibroblastos humanos adultos derivados de um paciente com ataxia de Friedreich foram visualizados após duas infecções consecutivas com meio retroviral GFP; quando os fibroblastos foram infectados por simples incubação com o meio viral, menos de 20% das células foram transduzidas. No entanto, quando a adição do meio retroviral GFP foi imediatamente seguida por centrifugação, a eficiência de transdução aumentou drasticamente.
Aqui, mais de 80% das células são transduzidas para realizar uma caracterização inicial das colônias de células IPS humanas isoladas. A expressão de marcadores de pluripotência característicos das células ES humanas foi avaliada por imunoquímica, conforme mostrado aqui. As colônias de células IPS humanas isoladas foram positivas para os marcadores de pluripotência.
T três quatro SOX dois nano SSEA quatro e TRA um 60 DNA. A coloração com Cos e DPI mostrada nos painéis superiores é detectada tanto nas colônias de células iPS humanas quanto nas células de suporte. Esses resultados demonstram que as células iPS humanas obtidas utilizando este protocolo de reprogramação expressam marcadores de pluripotência apropriados, característicos das células-tronco pluripotentes humanas indiferenciadas.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como reprogramar com sucesso fibroblastos humanos em células-tronco pluripotentes utilizando transdução retroviral para identificar corretamente colônias de células-tronco pluripotentes humanas e realizar a caracterização inicial de CTPHs.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para reprogramar fibroblastos humanos adultos em células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) utilizando vetores retrovirais. O processo envolve a transdução de fibroblastos com vetores que codificam fatores de transcrição essenciais e a identificação de células reprogramadas por meio de coloração em células vivas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Reprogramação Celular
- Função de Fator de Transcrição
Antecedentes
- Células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) podem ser geradas a partir de células somáticas.
- Vetores retrovirais são comumente usados para entrega gênica no reprogramamento.
- Os fatores de transcrição-chave envolvidos incluem Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-myc.
- Técnicas de coloração em células vivas ajudam a identificar células que foram reprogramadas com sucesso.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo eficiente para gerar hiPSCs a partir de fibroblastos humanos.
- Utilizar vetores retrovirais para a introdução de fatores de transcrição.
- Identificar células reprogramadas utilizando anticorpos específicos.
Métodos Utilizados
- Transdução de fibroblastos humanos com vetores retrovirais.
- Cultivo de fibroblastos infectados em células de apoio embrionárias de camundongo.
- Coloração de culturas com anticorpo TRA-1-81 para identificar colônias positivas.
- Transferência de colônias positivas para placas para expansão adicional.
Resultados Principais
- Reprogramação bem-sucedida de fibroblastos em hiPSC foi alcançada.
- A identificação de colônias reprogramadas foi confirmada por meio de coloração.
- Colônias expandidas exibiram características de células-tronco pluripotentes.
- O protocolo demonstrou eficiência na geração de hiPSC.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido é eficaz para o reprogramamento de células somáticas humanas.
- Vetores retrovirais são um método viável para introduzir os fatores de transcrição necessários.
- A coloração em células vivas é uma técnica confiável para identificar células reprogramadas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) permite a modelagem de doenças e a validação de alvos na fase inicial de descoberta. Este protocolo auxilia na redução de riscos mecanicistas ao gerar linhagens pluripotentes específicas do paciente para investigação de vias metabólicas. O isolamento e a expansão eficientes de colônias melhoram a confiabilidade preditiva na avaliação pré-clínica de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas utilizando fibroblastos derivados de pacientes reprogramados à pluripotência.
- Valor Operacional: Fornece uma fonte renovável de células humanas geneticamente definidas para estudos de interação com alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos mediante a caracterização de marcadores de pluripotência e potencial de diferenciação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera linhagens padronizadas de hiPSC adequadas para o desenvolvimento de ensaios e triagem de compostos.
- Valor Operacional: Permite a produção escalonável de linhagens celulares clonais para leituras fenotípicas reprodutíveis.
- Prontidão para Ensaios: Facilita a preparação de sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho de triagem downstream.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Apoia a progressão da descoberta à validação pré-clínica utilizando modelos de hiPSC relevantes para a doença.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a avaliação da modulação do alvo em contextos celulares humanos antes de estudos in vivo.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a avaliação de efeitos no alvo e modulação de vias em sistemas geneticamente equivalentes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até a otimização do composto líder, ao fornecer modelos celulares escalonáveis e relevantes para o ser humano.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias por meio de hiPSC derivados de fibroblastos de pacientes e controles reprogramados.
- Triagem: Fornece colônias clonais prontas para ensaios, com morfologia e expressão de marcadores consistentes, para avaliação de compostos.
- Análises: Permite a medição quantitativa de marcadores de pluripotência e de produtos de diferenciação para comparar condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais ao trabalho pré-clínico por meio da expansão e caracterização de linhagens estabelecidas de hiPSC.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para gerar linhagens celulares específicas de doenças em múltiplos alvos e indicações.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva por meio da geração de células pluripotentes com expressão validada de marcadores (TRA-1-60, SSEA-4, Oct3/4, Sox2, Nanog).
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de etapas definidas de seleção, isolamento e expansão de colônias.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos ao reduzir ambiguidades mecanicistas em estudos de validação de alvos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos utilizando modelos celulares humanos com fundos genéticos definidos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células-tronco, transdução viral e técnicas de imunofluorescência.
- Depende da produção de vetores retrovirais, eficiência de transdução de fibroblastos e manutenção de células alimentadoras.
- Necessita de protocolos padronizados para seleção de colônias, repicagem e análise de marcadores entre diferentes equipes.
- Envolve considerações de adaptação ao ser aplicado a diferentes tipos celulares ou modelos de doenças.
- Limitado pela necessidade de identificação cuidadosa de colônias verdadeiramente pluripotentes entre reprogramações parciais ou contaminação por fibroblastos.
