Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

O sistema Bio Flux é um instrumento automatizado e um dispositivo microfluídico para realizar ensaios com células vivas sob fluxo de cisalhamento controlado. Este sistema utiliza a tecnologia de microfluídica em placas de poços para integrar dispositivos de câmara de fluxo em escala micrométrica em placas de poços padrão SBS. O BioFlex pode ser utilizado para conduzir estudos de adesão e agregação de plaquetas com alto rendimento e volumes reduzidos de sangue.

Sangue total marcado com corante fluorescente é adicionado às cavidades e, em seguida, fluído através dos canais. Sob fluxo cisalhante controlado, são obtidos dados de microscopia de alta resolução, que quantificam a adesão e agregação de plaquetas na presença de compostos medicamentosos e outros parâmetros variáveis. Olá, sou Mike Schwartz do laboratório de P&D da Flexion Biosciences.

Hoje vamos mostrar um procedimento para o uso de células de fluxo microfluídicas em ensaios de adesão de plaquetas. Utilizamos este protocolo em nosso laboratório para uma variedade de ensaios de biologia vascular. Então, vamos começar.

Antes de realizar o experimento com a câmara de fluxo, os canais microfluídicos da placa bio flux devem ser preparados com um revestimento protéico de interesse; colágeno tipo I será utilizado neste experimento. Cada um dos 24 canais experimentais da placa bio flux conecta-se a um poço de entrada e a um poço de saída nesta placa. O poço de entrada é o poço à esquerda que alimenta o canal, e o poço de saída está à direita; dilua o estoque de colágeno tipo I para uma concentração de 200 microgramas por mililitro.

Em ácido acético 0,02 molar, serão necessários 20 microlitros para cada canal utilizado. Como este experimento requer 11 canais, prepare 200 microlitros de revestimento de colágeno. Um canal permanece sem revestimento, misturado por iteração suave com a ponteira de uma micropipeta.

Adicione 20 microlitros do revestimento a cada canal respectivo utilizando uma micropipeta para dispensar o líquido no orifício interno do poço. Alimente o canal microfluídico de interesse, como mostrado aqui com o corante amarelo, incluindo um canal sem colágeno como controle negativo para adesão e agregação de plaquetas. Após o revestimento com colágeno ter sido adicionado a todos os canais respectivos, conecte a interface à placa.

Se você estiver usando a interface bio flux 1000, poderá travar ambas as travas na platina. Se estiver usando a interface Bio flux 200, aperte primeiro os quatro parafusos com os dedos. Em seguida, quando todos estiverem posicionados, use a chave de torque para apertar completamente.

O torquímetro emitirá um clique ao atingir o máximo. Usando o modo manual no software bio flux, aplique perfusão aos canais de interesse a 2D por centímetro quadrado a partir da saída. Usaremos uma objetiva de baixa potência em um microscópio para localizar o poço de entrada e observar o preenchimento com líquido do orifício interno oposto.

Você deverá observar inicialmente uma pequena gota de líquido, preenchendo lentamente o pino interno após vários minutos; quando o pino interno da entrada estiver cheio, interrompa o fluxo em todos os canais pressionando parar no software. Incube a placa à temperatura ambiente por uma hora. Durante este período de incubação, você pode começar a preparar o sangue total ao final da incubação de uma hora.

Uma vez que o sangue tenha sido preparado, remova a interface e adicione um mililitro de PBS com íons cálcio e magnésio à saída. Inicie a perfusão a partir do poço de saída a dois dinas por centímetro quadrado e continue a perfusão por 10 minutos. Após 10 minutos, interrompa a perfusão. Após a remoção da interface, remova o excesso de PBS de ambos os poços de entrada e saída.

Nunca remova o líquido que preenche o punção interno. Para bloquear os canais, adicione um mililitro de solução bloqueadora a cada saída. O poço a ser usado deve ser perfundido a partir do poço de saída a dois dinas por centímetro quadrado e continuar a perfusão por 10 minutos.

Interrompa a perfusão após 10 minutos e remova a interface. Os canais agora estão prontos e podem ser utilizados durante o dia enquanto a placa está sendo revestida com colágeno. Durante uma incubação de uma hora, o sangue humano fresco de um indivíduo em jejum deve ser preparado para a imagem e para passagem pela placa.

O sangue deve ser coletado em citrato de sódio, anticoagulante, e utilizado dentro de três horas após a coleta. Primeiro, adicione um estoque de quatro milimolares de cálcio M em DMSO ao sangue em uma diluição de um para 1000 volume por volume. Para obter quatro micromolares de cálcio, misture por inversão suave.

Em seguida, distribua um mililitro do sangue marcado com amida de cálcio em dez tubos microfugáveis de um ponto cinco mililitros. Adicione o anticorpo inibidor GP dois B três a a cada tubo na diluição desejada. Certifique-se de incluir um controle negativo sem anticorpo e um controle positivo com anticorpo não relacionado, misturados por inversão suave.

Incube os tubos à temperatura ambiente por uma hora, misturando por inversão suave a cada 10 minutos antes de realizar o experimento na câmara de fluxo. Um protocolo automatizado deve ser configurado no módulo de controle bio flux para colágeno.Um. Configure um protocolo para fluir o sangue a dez nove centímetros quadrados por 10 minutos a partir da saída.

Bem, utilizando a estação de trabalho BioFlex 1000, os parâmetros de aquisição de dados devem ser configurados, incluindo as posições desejadas do estágio, a aquisição no comprimento de onda fitz e a configuração de intervalo de tempo. Um plano típico de aquisição de imagens para este protocolo compreenderia um campo de visão por canal a ser capturado usando uma objetiva de 10 x a cada 30 segundos, durante uma duração total de 10 minutos. Também são possíveis campos de visão adicionais e configurações alternativas de intervalo de tempo.

Uma vez que o protocolo automatizado e os parâmetros de aquisição de dados tenham sido configurados, retorne à placa BioFlex e remova o líquido de ambos os lados do canal, exceto nas perfurações internas. Tendo o cuidado de trabalhar rapidamente, adicione 500 microlitros de sangue de cada condição nos poços de saída de cada canal. Observe que os poços de saída estão sendo utilizados para a entrega do sangue porque representam o caminho mais curto até a zona de visualização e proporcionarão uma reação mais imediata do sangue ao revestimento de colágeno.

Além disso, coloque o sangue controle sem anticorpo em um canal revestido com colágeno e em outro que apenas foi bloqueado. Coloque a placa no microscópio da estação de trabalho BioFlex 1000 e fixe a interface. Realize a calibração da lista de estágios localizando o primeiro ponto de calibração, definido como a origem.

Em seguida, localize e marque o segundo ponto de calibração. Aplique essa calibração à lista de estágios apropriada. Isso garante que todos os locais de visualização na placa possam ser encontrados automaticamente.

Mova o estágio para um dos canais contendo sangue, ajuste os parâmetros de captura de imagem, como tempo de exposição e ganho, no software BioFlex montage. Inicie o fluxo de trabalho apropriado clicando no botão desejado. Isso iniciará simultaneamente o protocolo de fluxo e a aquisição de imagens.

No final do experimento, remova a placa da estação de trabalho BIOFLU 1000 e descarte-a de acordo com as diretrizes institucionais. Utilizando canais microfluídicos revestidos com colágeno do sistema bio flux. A formação agressiva de trombos é observada ao longo do tempo com a amostra de sangue controle não tratada.

Em contraste, nenhuma formação de trombo é observada com o canal não revestido. Em um experimento realizado recentemente, o tamanho médio dos agregados sob condições controle foi de 2000 micrômetros quadrados. A GP dois B três A é um mediador potente das interações entre plaquetas e da estabilização da agregação plaquetária quando ativada pela adesão ao colágeno; como mostrado aqui após incubação com anticorpo anti-GP dois B três A por uma hora antes da exposição ao cisalhamento, observa-se uma redução no tamanho dos trombos, bem como uma diminuição na frequência de formação de trombos.

Uma resposta dependente da dose pode geralmente ser observada em 10⁹ cm² e o valor de IC50 para este inibidor específico foi de 17 nanomolar. A inibição máxima para este doador, comparada ao controle sem anticorpo, foi de 11% em 10⁸ cm². Uma placa de alto cisalhamento com 48 poços também está disponível para realizar experimentos com sangue total até 200 dina/cm² ou 5.000 s⁻¹.

Acabamos de mostrar como usar canais de fluxo microfluídicos para realizar experimentos de biologia vascular fisiologicamente relevantes. Ao executar este protocolo, é importante lembrar-se de diluir o colágeno no tampão correto. Utilize sempre a técnica correta de pipetagem para evitar a introdução de bolhas de ar e siga sempre as normas de biossegurança do seu laboratório.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.