Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

Olá e bem-vindo ao Grupo de Biologia Estrutural e Funcional de Membranas. Meu nome é Martin Caffery. O foco da nossa pesquisa é a membrana biológica, cujo esquema é mostrado no primeiro slide. A membrana que envolve a célula e as organelas subcelulares, quando presentes, é uma estrutura molecularmente fina, com apenas duas camadas de moléculas lipídicas de espessura e salpicada de proteínas.

Estamos interessados na estrutura e nas funções aplicadas a lipídios e proteínas. No entanto, para fins desta série JO, limitarei meu foco às proteínas de membrana. Buscamos compreender como essas proteínas de membrana funcionam em nível molecular por dois motivos.

Primeiramente, há a satisfação intelectual em saber como algo funciona. Em segundo lugar, ao saber como funciona, assim como sua bicicleta ou carro, há a possibilidade de consertá-lo se apresentar mau funcionamento. O design de fármacos é uma consequência evidente desse tipo de trabalho.

A abordagem que adotamos para descobrir como uma proteína de membrana funciona em nível molecular é determinar sua estrutura cristalográfica. Isso envolve estabelecer a localização no espaço tridimensional de todos os átomos, ou pelo menos de todos os átomos não hidrogênio que compõem a proteína. O método que utilizamos para esse fim é chamado cristalografia de raios X de macromoléculas, MX abreviadamente.

Aqui vemos um exemplo de uma proteína de membrana cuja estrutura foi determinada usando cristalografia de raios X (MX), na qual é necessária uma fração de cristal de qualidade da proteína para realizar a MX. Como é possível imaginar, há muitas etapas envolvidas na determinação da estrutura por meio da cristalografia macromolecular, conforme ilustrado aqui. Tipicamente, essas etapas incluem identificar um alvo proteico de membrana e, em seguida, produzir, purificar e cristalizá-lo.

As medições de difração são realizadas no cristal utilizando uma fonte de raios X caseira ou de sincrotrão. Os dados de difração são processados, gerando um mapa de densidade eletrônica, que é então ajustado a um modelo molecular. O modelo, quando refinado, pode ser utilizado para investigar o mecanismo de ação da proteína e para o planejamento de fármacos baseado em estrutura.

O foco deste artigo da JOVE é mostrar como produzimos cristais de proteínas de membrana de qualidade fracionada utilizando fases mesofásicas lipídicas pelo chamado método in meso. Uma revisão recente sobre o método e seu escopo está disponível na referência um. O protocolo passo a passo que seguiremos aqui é descrito em referência a um fluxograma que resume os passos envolvidos e o tempo necessário para montar um ensaio de cristalização de proteína de membrana in meso, mostrado aqui.

Este vídeo abrange as etapas delimitadas pelas linhas vermelhas tracejadas. Os itens necessários para realizar a cristalização em mesofase no modo manual são mostrados aqui. Eles incluem uma solução concentrada da proteína de membrana purificada e lipídio para criar a mesofase hospedeira, geralmente monooleína, para tornar o lipídio mais evidente.

Neste vídeo, foram utilizadas soluções corantes vermelhas precipitantes, dispositivos de tubo com água purificada, ponteiras descartáveis e uma variedade de seringas gastight da Hamilton, algumas com agulhas removíveis, um acoplador de furo estreito usado para misturar a solução proteica com o lipídio e produzir a mease. Um dispensador repetidor da Hamilton, lâminas de microscópio de vidro e lamínulas. Idealmente, fita espaçadora dupla adesiva perfurada silanizada para a criação de poços, pinça, gelo triturado, tecidos absorventes, uma calculadora e, mais importante de tudo, o seu caderno de laboratório.

O procedimento a seguir é utilizado para preparar uma placa de cristalização em sanduíche de vidro. Para o carregamento, coloque uma lâmina de microscópio silanizada sobre a bancada. Remova a cobertura protetora de papel de uma superfície de uma tira de fita espaçadora adesiva dupla face perfurada.

Coloque a fita com o lado adesivo voltado para baixo em contato com a superfície da lâmina sob pressão. Sobre a fita à lâmina. Usando um rolo ou cilindro, uma folha de alumínio pode ser colocada entre a fita e o rolo para proteger a base dos poços.

Remova a segunda capa de papel da fita para expor sua superfície adesiva superior. Este procedimento gera uma lâmina de vidro pronta para o carregamento e posterior vedação assim que o carregamento for concluído. Coloque lamínulas individualmente silanizadas em proximidade próxima à lâmina para uma vedação rápida e eficiente dos poços.

Coloque o lipídio em um bloco com controle de temperatura a 45 graus Celsius durante três minutos para torná-lo fundido. Observe que o lipídio utilizado é tipicamente mono land. Neste vídeo, o lipídio contém um corante vermelho adicionado para melhor visibilidade enquanto o lipídio está derretendo.

Prepare duas seringas estéreis de 100 microlitros da Hamilton para uso na etapa de mistura de lipídeo e proteína; remova o óleo de fúrcula de teflon da seringa que conterá a solução proteica. Coloque a seringa que manterá o lipídeo ao lado dela. Neste caso, a fúrcula permanece no lugar.

Coloque o acoplador de orifício estreito entre as duas seringas e, em seguida, conecte o acoplador ao dedo da seringa de lipídio. Aperte o acoplador na seringa, mas não aperte em excesso. Remova o êmbolo do corpo da seringa de lipídio.

Certifique-se de que o lipídio está fundido. Ajuste a pipeta para 30 microlitros e aspire lentamente 30 microlitros da tampa de lipídio fundido. O frasco de lipídio.

O lipídio deve ser armazenado sob nitrogênio ou argônio a menos 80 graus Celsius. Lentamente, adicione o máximo possível do lipídio fundido na extremidade aberta da seringa, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar.

Coloque o êmbolo dentro do cilindro em contato com o leopardo fundido e avance lentamente o êmbolo pelo cilindro com a seringa mantida na posição vertical. Como mostrado, a bolha de ar aprisionada acidentalmente sobe durante o processo e é liberada. Agora temos um filete de lipídio fundido no interior do cilindro, cujo volume você deve determinar com precisão.

Isso pode ser feito lendo as marcações no corpo da seringa. Neste caso, o volume é de 23 microlitros, que deve ser registrado no caderno de laboratório. Deslize a pele sobre a agulha que se estende a partir do acoplador.

Use o êmbolo para forçar o lipídio fundido para cima do cilindro e lentamente, com cuidado, para dentro da agulha no núcleo do acoplador. Se a agulha estiver ligeiramente superpreenchida, o lipídio será visto saindo pulsante de sua extremidade aberta. Ao recuar ligeiramente o êmbolo, o excesso de lipídio pode ser recolhido para dentro do acoplador até ficar exatamente nivelado com a ponta da agulha do acoplador.

Neste caso, a unidade acopladora de seringa está completamente carregada e pronta para ser combinada com a seringa de proteína. A solução deve ser centrifugada a 14.000 G durante 10 minutos, de cinco a dez minutos a quatro graus Celsius, para remover agregados grandes. Antes de montar os ensaios de cristalização, retire a solução de proteína do balde com gelo e equilibre-a à temperatura ambiente.

Calcule o volume da solução proteica a ser usado para formar a fase cúbica em ou próximo à hidratação completa para o olean a 20 graus Celsius. A hidratação completa com água ocorre em cerca de 40% em peso de água, conforme indicado no diagrama de fases. Lembre-se de que carregamos a seringa de lipídio com 23 de mono a uma densidade de 0,94 miligramas por microlitro.

Isso corresponde a 21,6 miligramas de lipídio; portanto, 21,6 vezes quatro dividido por seis, ou seja, 14,4 miligramas ou 14,4 microlitros de solução proteica, são necessários. Com uma seringa Hamilton de 25 ou 50 microlitros, aspire o volume necessário de solução proteica e transfira a solução para a ponta de teflon do êmbolo no cilindro da solução proteica. Tendo o cuidado de evitar bolhas de ar, retire cuidadosamente a agulha e meça o volume de solução proteica na seringa. Ele deve corresponder ao valor obtido no passo anterior.

Em preparação para a combinação com a seringa carregada com lipídio. Lentamente, empurre a solução proteica ao longo do corpo da seringa até ficar alinhada com sua extremidade aberta. Isso pode ser observado olhando-se através da extremidade final do corpo da seringa.

A solução proteica de lipina, com as seringas carregadas, está agora pronta para ser combinada na preparação para a formação de Mex. Para isso, rosqueie a seringa contendo a proteína na extremidade aberta do acoplador ligado à seringa contendo lipídios. Após unir as duas seringas por meio do acoplador, deve existir um volume contínuo de líquido, desde o lipídio em uma seringa, passando pelo acoplador, até a solução proteica na outra seringa.

Em preparação para a mistura, a unidade montada é segurada com uma seringa na mão direita e a outra na esquerda. Aplica-se torque a ambos os cilindros até o acoplador, utilizando os dedos e polegares das duas mãos para garantir que o selo contra as ranhuras no acoplador permaneça intacto após o aperto. O dispositivo de mistura montado nesta fase pode danificar a ALS e o aperto insuficiente também causará vazamentos.

É uma questão de experiência com os inevitáveis tentativas e erros e perdas ocasionais de amostra. Portanto, vale a pena praticar com lipídio e água ou solução tampão para se familiarizar com o sistema antes de utilizar uma solução proteica valiosa para promover a mistura; avance o êmbolo no lado proteico da unidade de mistura montada até seu limite com o polegar ou o indicador, empurrando a solução proteica para fora da seringa proteica através do acoplador e para dentro da seringa de lipídio. Se a unidade tiver sido selada efetivamente, essa ação causará um movimento igual e oposto do êmbolo no lado lipídico.

O êmbolo do lado dos lipídios é agora usado para empurrar o conteúdo da seringa de lipídios de volta através do cooler e para dentro da seringa de proteína. Esse processo é repetido várias vezes. Ocasionalmente, são necessárias cem passagens ou mais para produzir uma fase mista homogênea.

No início da mistura, o movimento do material para frente e para trás através do acoplador pode ser irregular, e às vezes é necessária força adicional para efetuar a mistura. Isso é esperado. A mistura inicial é geralmente acompanhada pelo surgimento de uma turvação não uniforme na amostra, o que também é esperado.

À medida que a homogeneização progride, a textura, conforme percebida pela força necessária para mover os êmbolos para frente e para trás, torna-se mais uniforme e característica da fase cúbica viscosa, assim como a aparência visual da fase cúbica emergente. Se as condições forem apropriadas e a fase cúbica se formar, a dispersão deverá parecer opticamente transparente no corpo da seringa.

Assim, as marcações no corpo da seringa devem ser claramente legíveis através da fase meso no interior do corpo. No caso de proteínas coloridas, a fase meso terá a cor da proteína, mas será opticamente transparente. Um resfriamento muito leve da amostra durante a mistura, colocando o misturador de seringas por um curto período sobre gelo, pode acelerar a homogeneização e a obtenção de transparência.

No entanto, é importante não exagerar na manipulação da amostra; deve-se ter cuidado para evitar uma mistura excessivamente vigorosa, pois isso pode elevar a temperatura da amostra devido ao aquecimento por fricção. Neste momento, a fase cúbica de misa já foi formada e a proteína foi reconstruída na bicamada lipídica. A fase de misa está agora pronta para ser distribuída nos poços individuais das placas de cristalização.

Primeiro, no entanto, a fase meso deve ser transferida para uma seringa Hamilton de 10 microlitros montada em um dispensador repetitivo. Inicie este processo acoplando a seringa ao dispensador com cuidado. Carregue a seringa com a fase cúbica.

Remova a agulha e o êmbolo da seringa. Deixe o filtro de teflon no lugar. Remova a porca de retenção do dispensador com a ajuda de uma moeda pequena.

Com o braço do catraca totalmente recolhido, insira a seringa sem seu êmbolo e agulha através do anel de fixação do dispensador. Substitua a junta de retenção com o lado do nó voltado para a seringa e rosqueie firmemente na extremidade aberta da seringa.

Deve-se ter cuidado para garantir que a seringa esteja corretamente centralizada no anel de fixação e que o corpo esteja alinhado paralelamente ao braço do catraca. Ambos os aspectos podem ser avaliados por I. Esses dois requisitos são importantes porque, se o êmbolo não se mover livremente, a pressão se acumulará na seringa de origem durante o carregamento e poderá ocorrer vazamento. Passe o êmbolo através do anel de fixação com a porca de fixação, desparafusada algumas voltas, e guie o êmbolo até a extremidade aberta da seringa.

Pressione completamente o braço do catraca para mover o êmbolo para dentro do corpo e verifique se ele se desloca livremente ao longo do corpo. Se o parafuso e a barra de guia foram afrouxados, aperte-os novamente e verifique se o êmbolo se move livremente. A seringa de dispensação está agora pronta para ser carregada.

Mova o êmbolo em um dos lados da unidade de mistura montada até a marca de graduação de zero microlitro. Para transferir a fase meso para a outra seringa e o acoplador. Desconecte a seringa vazia com sua UL no lugar da unidade de mistura e conecte imediatamente a seringa carregada com o acoplador anexado à extremidade roscada da seringa dispensadora de 10 microlitros.

O grau de firmeza com que o acoplamento é feito é crítico. Como já mencionado, carregue a seringa de dispensação pressionando o êmbolo da seringa de 100 microlitros para que a fase mesogênica seja transferida através do acoplador. Se o acoplamento for firme e o êmbolo da seringa de dispensação mover-se livremente, então o êmbolo deverá começar a se mover na mesma direção do êmbolo de carregamento à medida que a seringa de dispensação for preenchida.

Desconecte a seringa de carga com o acoplador preso da seringa de dispensação. Fixe uma agulha curta com ponta plana à extremidade de aço da seringa de dispensação e aperte-a cuidadosamente. Prenda o êmbolo ao braço do catraca apertando o nó no anel de fixação.

Deve-se ter cuidado para não apertar excessivamente o nó, pois isso pode riscar e deformar o êmbolo, tornando-o inutilizável. É importante que a amplitude de movimento fornecida ao braço do catraca na condição fixada seja limitada a não mais de uma polegada.

Como mostrado além disso, o êmbolo tenderá a entortar e a administração poderá falhar. Pressione o tambor de catraca várias vezes para avançar o êmbolo dentro do corpo da seringa, preenchendo assim o volume morto da agulha e carregando-a. Este passo deve ser repetido até 10 vezes até que um filete contínuo da fase mesa surja da ponta da agulha.

A agulha está agora pronta para uso no preparo de ensaios de cristalização, que devem ser iniciados imediatamente. Não é aconselhável manter a fase cúbica carregada com proteína por muito tempo antes de preparar os ensaios de cristalização. Como algumas proteínas são instáveis na fase cúbica na ausência de precipitante adicionado, coloque uma placa de cristalização de múltiplos poços e uma lamínula sobre uma superfície elevada alguns centímetros acima da bancada, para facilitar o carregamento.

O contraste ideal e a visibilidade aprimorada são alcançados quando a superfície é levemente escura. Homogeneíze as soluções de precipitante e retire as tampas dos frascos. Ajuste a pipeta de dispensação de precipitante para um microlitro com a seringa de dispensação mantida verticalmente em uma das mãos; use a outra mão para posicionar a ponta da agulha no centro e diretamente acima da base do poço.

Número um. Pressione o botão do dispensador repetitivo para expelir um bolo de mease sobre a superfície de vidro. O volume do bolo é de 200 nanolitros.

Quando o dispensador padrão repetitivo é usado com uma seringa de 10 microlitros, a ponta da agulha deve estar a não mais que algumas centenas de micrômetros acima da base do poço. Para garantir uma entrega adequada, a entrega reprodutível é facilmente alcançada. Basta um pouco de prática. Após os quatro poços adjacentes serem carregados com o bolo de mease, coloque um microlitro da solução precipitante sobre cada bolo de mease.

Usando dois microlitros por poço e ponteiras descartáveis padrão o mais rapidamente possível, posicione uma lamínula diretamente sobre os poços preenchidos para cobri-los uniformemente e obter um selo impermeável. Use uma espátula para aplicar pressão sobre a lamínula no ponto em que ela entra em contato com a superfície adesiva exposta da fita espaçadora. O processo de dispensação do agente de cristalização e do precipitante pode ser repetido até que todos os poços da placa sejam carregados e selados.

A placa está agora pronta para inspeção e incubação. Rotule a placa claramente para fins de rastreamento. Proteínas sensíveis à luz são geralmente manipuladas envolvendo-se as placas em folha de alumínio antes de colocá-las na câmara de incubação.

Estes podem ser removidos e examinados ao microscópio sob luz suave ou adequadamente colorida. Coloque as placas em uma câmara com temperatura controlada, geralmente a 20 graus Celsius ou em torno disso, em intervalos regulares. Inspecione as paredes em busca de crescimento de cristais utilizando um microscópio de luz polarizada com aumento de 10 ou 20 vezes.

Objetivo, o cronograma utilizado no laboratório do autor é o seguinte: dias 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 pós-implante. Inspecione cuidadosamente o bolo fecal. Ajuste a profundidade de foco dentro da amostra com espessura de 140 mícrons.

O exame deve ser realizado tanto em luz normal quanto entre polarizadores cruzados. Cristais incolores de proteínas de membrana crescendo na fase cúbica, quando observados com luz normal, parecem com isso. Cristais incolores de proteínas de membrana crescendo em meio mesofásico, quando observados com luz polarizada, parecem com isso ou com isso; proteínas de membrana naturalmente coloridas crescendo em meio mesofásico, quando observadas com luz normal, parecem com isso ou com isso.

Os próximos passos no processo geral de determinação estrutural são colher e resfriar criogenicamente os cristais, bem como registrar e processar a difração de raios X proveniente deles. Esses tópicos são abordados em artigos separados do JoVE nesta série.