Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

O objetivo geral deste procedimento é identificar as condições mais adequadas de cristalização bidimensional para a determinação estrutural de proteínas de membrana por cristalografia eletrônica. Isso é realizado primeiramente utilizando um detergente compatível durante a purificação, a fim de solubilizar a proteína a partir da bicamada lipídica nativa. O segundo passo do procedimento consiste em adicionar lipídio exógeno e remover o detergente por meio de diálise da mistura de proteína, lipídio e detergente, resultando em cristais bidimensionais sob condições cuidadosamente controladas.

O terceiro passo do procedimento é congelar rapidamente as amostras em um estado vítreo. O passo final do procedimento é coletar dados por criomicroscopia eletrônica. Em última análise, podem-se obter resultados que revelam a estrutura final da proteína por meio do processamento computacional das imagens dos dados.

Olá, sou do laboratório da Escola de Biologia do Instituto de Tecnologia da Geórgia. Olá, sou Tina Dreaded.

Sou do Laboratório Berry da Escola de Química e Bioquímica e do Laboratório Schmidt Kray da Escola de Biologia do Instituto de Tecnologia da Geórgia. E eu sou Matt Johnson do laboratório de Ingleborg Schmidt Cry da Escola de Biologia do Instituto de Tecnologia da Geórgia. Hoje vamos mostrar um procedimento para avaliar ensaios de cristalização em 2D por microscopia eletrônica.

Utilizamos este protocolo em nosso laboratório para identificar e otimizar as condições de cristalização em 2D. Então, vamos começar. Para iniciar este procedimento, preparam-se amostras com contraste negativo em grades de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de cobre com malha 400 revestidas com carbono. Pipete dois microlitros da amostra de proteolipossoma sob uma grade de TEM recoberta com carbono e incube por 60 segundos.

Se a amostra não se distribuir uniformemente, passe suavemente com a lateral da ponteira do pipeto. Em seguida, tamponar a partir da borda com um pedaço rasgado de papel filtro Watman número quatro. Isso garante a remoção ideal do líquido sem remoção excessiva de lipossomos de proteína, ajudando a preservar a delicada película de carbono.

Imediatamente após a remoção do líquido. Aplique dois microlitros da solução corante de acetato de uranila a 1% após 30 segundos, removendo o excesso pela borda da grade. Novamente, se a amostra contiver altas concentrações de glicerol ou sacarose viscosos, tipicamente na faixa de 10 a 20%, vários ciclos de lavagem da grade com um tampão livre de glicerol ou sacarose antes da coloração negativa podem ser úteis para permitir uma adequada coloração com a solução de acetato de uranila.

Uma vez que as grades tenham sido preparadas, a microscopia eletrônica é utilizada para visualizar a amostra em baixa ampliação, a fim de avaliar a distribuição da ocorrência de membranas, a morfologia e a qualidade geral da grade. Em seguida, utiliza-se alta ampliação para obter imagens e realizar transformadas RIA das imagens, a fim de identificar cristais bidimensionais. Para iniciar, coloque a grade no porta-amostras do microscópio eletrônico e, para obter uma primeira impressão da distribuição média das membranas, utilize uma ampliação intermediária de 2.000 a 10.000 x.

Observe a extensão da distribuição das membranas, sua morfologia e tamanho em um caderno de laboratório. Registre vistas representativas com uma câmera CCD. Em seguida, se necessário, observe as amostras com baixa ampliação na faixa de aproximadamente 400 a 800 x para obter uma visão geral das grades.

Isso pode fornecer informações valiosas para avaliar a preparação da grade, revelando problemas com a concentração da amostra, distribuição desigual de proteas, lipossomos e rompimento parcial do filme de carbono. Identifique uma área de interesse na grade em baixa ou média magnificação. Em seguida, utilize alta magnificação para avaliar a possível ordem em diferentes membranas.

Isso é crítico nas fases iniciais de ensaios de cristalização em 2D. A fim de identificar lipossomos de proteína promissores com áreas bem ordenadas e verificar a reprodutibilidade em experimentos posteriores para determinar a configuração ideal de alta magnificação para triagem de cristais em 2D, comece com uma magnificação entre 50.000 e 60.000 ×. Dependendo das dimensões do cristal em 2D e do tamanho da célula unitária, a configuração de alta magnificação pode ser reduzida até 30.000 ou aumentada até 80.000.

Aqui, em uma localização adjacente à área de interesse da imagem, desfocamos em aproximadamente menos 400 nanômetros ou mais, caso haja incerteza quanto à área de interesse ser realmente uma membrana. Inspecione a amostra em busca de fragmentos de filme de carbono, MICA ou outros artefatos que possam ser confundidos com proteolipossomos. Observe também as bordas para identificar dobramentos e morfologia típicos de membranas.

Em seguida, inspecione a área de interesse com uma câmera CCD. Ao coletar uma imagem CCD na configuração ótima de alta ampliação, a rede de uma proteína de membrana menor e/ou predominantemente hidrofóbica pode não ser observável pela avaliação visual da própria imagem CCD. Nesse caso, a imagem inteira é utilizada para uma transformada rápida de Fourier online ou ft.

No entanto, se a matriz ordenada for pequena, esta TF conterá uma quantidade significativa de ruído; para melhorar a relação sinal-ruído, reduza o tamanho da imagem recortada, mova a caixa reduzida sobre a imagem e realize uma TF em tempo real, ajustando a função gama da TF em tempo real para identificação ideal de matrizes ordenadas. Um valor de gama excessivamente alto pode obscurecer pontos devido a contribuições de ruído, enquanto um valor excessivamente baixo impedirá a identificação de pontos mais fracos. Espere que a resolução dos cristais 2D com contraste negativo seja de aproximadamente 15 angstroms a uma DFO de menos 400 nanômetros.

Espera-se identificar de uma a três ordens de pontos. Observe a nitidez dos pontos e qualquer mosaico. Cristais 2D de uma pequena proteína de membrana de 18 quilodaltons têm até várias micras de tamanho.

Manchas na TDF nítidas e com movimento facilmente identificável da caixa FT viva indicam que o reticulado é contínuo, sem mosaico. O reticulado de uma proteína maior com um domínio solúvel mais extenso pode ser identificado na pequena tela da coleta de imagens por T-E-M-C-C-D, e as TDFs são necessárias para obter uma avaliação mais precisa da qualidade do reticulado, incluindo características como ruído em mosaico na TDF de uma proteína desordenada. Lipossomos podem ser confundidos com manchas fracas; é necessário determinar se as manchas são devidas a cristais 2D de proteína pequena ou ao ruído.

Mova a caixa para o ft em tempo real. Se os pontos desaparecerem imediatamente, são ruído; mas se permanecerem inalterados mesmo em uma pequena área, é provável que haja cristais, já que os cristais lipídicos exibem uma morfologia distinta e ft. Esses cristais lipídicos também podem ser reconhecidos pela inspeção visual de uma imagem e tamanhos consistentes de célula unitária.

A precipitação pode ocorrer nos ensaios iniciais. A inspeção em alta ampliação é utilizada para distinguir entre precipitação proteica e agregados lipídicos. No caso de agregados lipídicos, a reconstrução pode ter realmente ocorrido e os próximos experimentos exigirão apenas o ajuste de parâmetros necessários para aumentar o tamanho da membrana e produzir ordem, em vez de induzir a reconstrução em 30.000 a 50.000 x.

As bordas dessas estruturas escuras revelam que elas são compostas por membranas sem proteína. Amostras de precipitação em condições ideais conterão uma grande porcentagem de cristais bidimensionais. Não é necessário buscar uma aparência homogênea das membranas, pois os cristais bidimensionais maiores e mais bem ordenados são selecionados visualmente para a coleta de dados.

Esses tipos de amostras serão facilmente reconhecidos quando a cristalização dessas amostras for utilizada para coleta de dados de microscopia crioeletrônica, visando obter o número máximo de imagens de alta resolução. Mostraremos apenas como realizar a triagem de cristais 2D de pequenas proteínas de memória por microscopia eletrônica de transmissão ao executar este procedimento. É importante lembrar-se de ser minucioso para não deixar passar uma condição de cristalização promissora, já que você já investiu uma quantidade significativa de tempo e esforço até este momento.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.