De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Este vídeo demonstrará um método para montar ensaios de cristalização de alto rendimento de proteínas de membrana purificadas utilizando células B lipídicas. Primeiro, as células B são preparadas misturando um lipídio e um detergente; a proteína de membrana purificada é então incorporada à mistura de células B e os ensaios de cristalização são realizados usando um robô de nanolitros para inspeção visual. A utilização de um microscópio óptico padrão revela a presença de cristais.

Uma vez formados, os cristais proteicos podem ser extraídos e congelados para coleta de dados e determinação da estrutura. A principal vantagem dessa técnica é que, devido ao comportamento de fase único das células B, equipamentos e robótica padrão disponíveis no laboratório podem ser utilizados para a cristalização. Preparar células B é uma técnica tão simples que permite retirar sua proteína de membrana alvo do micélio de detergente e colocá-la em um meio lipídico.

Isso lhe fornece um conjunto totalmente novo de condições para triagem. É um método tão simples que já foi usado com sucesso em muitas proteínas de membrana, não havendo razão para não tentá-lo. O primeiro passo na cristalização baseada em células B é a preparação de uma mistura de lípido anfifílico formadora de células B.

Esse processo exige um esforço considerável e é o mais demorado. Observe que pode levar várias horas para ser concluído. As células B podem se formar em diversas combinações de anfifílicos lipídicos e em uma ampla faixa de concentrações.

Para pontos de partida sugeridos, consulte a tabela um no protocolo escrito. Comece preparando um mililitro da mistura de capso 35% DMPC numa razão molar de 2,8 para um. Para isso, pese 0,26 gramas de DMPC e 0,09 gramas de Chapo em um tubo. Complete o volume até 1,0 mililitro utilizando água deionizada e vórtex a mistura.

Em seguida, aqueça a mistura a aproximadamente 40 graus Celsius em banho-maria até que ela se torne gelatinosa. Coloque o tubo em gelo. A amostra deve voltar a ficar fluida novamente.

Em seguida, agite novamente em vórtex por alguns minutos e continue repetindo os ciclos de aquecimento, resfriamento e agitação até que o lipídio esteja completamente dissolvido. Observe que, conforme mais ciclos forem realizados, a mistura pode ficar turva durante o resfriamento ao finalizar. A mistura será um gel transparente em temperatura ambiente ou acima, e um líquido viscoso em gelo; as células podem ser armazenadas a -20 graus Celsius para conservação de longo prazo.

A seguir, as proteínas purificadas são incorporadas ao meio das células B. Este é um processo simples e deve ser realizado no mesmo dia da cristalização, o que é mostrado na próxima seção do vídeo. Deixe o gel fundido de DMPC capso para as células B em temperatura ambiente até que a fase mude para um gel transparente.

Coloque a mistura no gelo para liquefazê-la e, em seguida, vorteie brevemente para restabelecer uma fase homogênea de linfócitos B. A partir desse momento, mantenha a mistura de linfócitos B e a proteína purificada no gelo. Isso manterá os linfócitos B em fase líquida, facilitando a pipetagem.

Em seguida, adicione a mistura de células B à proteína solubilizada com detergente purificada numa proporção de um para quatro, volume por volume. Em seguida, pipete suavemente para cima e para baixo até que a solução fique clara e homogênea. Se aparecerem bolhas, gire brevemente em uma centrífuga de bancada para removê-las.

Incube a mistura em gelo por pelo menos 30 minutos para promover a incorporação completa da proteína nas células. A mistura de proteína com células está agora pronta para os ensaios de cristalização. Os ensaios de cristalização serão demonstrados utilizando um robô de cristalização mosquito.

Resfrie uma placa de 96 poços com fundo em V colocando-a sobre gelo. Pipete a mistura de proteína por célula na placa para garantir que a viscosidade da solução seja mínima. Mantenha a mistura de proteína por célula sobre gelo até a etapa final.

O robô utilizado aqui possui cinco plataformas. Coloque a microplaca contendo o reservatório na plataforma três e a tampa de cristalização, na qual as gotas serão dispensadas, na plataforma cinco. Em seguida, coloque a placa de proteína por célula na plataforma quatro, mais próxima da posição de dispensação.

Isso garante que a mistura de proteína com célula seja a última a ser coletada pelo robô e seja imediatamente liberada. Utilizando o software, inicie a execução; o robô coletará primeiro a solução do reservatório, seguida pela mistura de proteína com célula, e as dispensará na tampa em forma de gotas, para evitar aquecimento e aumento da viscosidade durante a dispensação. Não programe o mosquito para misturar o reservatório com a mistura de proteína com célula assim que a execução for concluída.

Retire a placa de proteína de cristalização do instrumento e coloque-a sobre gelo. Remova a tampa do instrumento e coloque-a sobre a placa contendo a solução reservatório de forma que as gotas fiquem invertidas. Incube a placa a 20 graus Celsius.

Observe que outras temperaturas também podem ser testadas para a formação e otimização de cristais. Temperaturas mais elevadas induzem a fase lamelar, que tem a vantagem de pré-organizar a proteína em camadas. Temperaturas entre quatro graus Celsius e 20 graus Celsius podem ser testadas.

Temperaturas abaixo de quatro graus Celsius podem causar a precipitação dos lipídios ao longo de períodos prolongados, no primeiro e terceiro dia e semanalmente a partir de então; avalie a aparência e o crescimento dos cristais utilizando um microscópio óptico padrão. São mostradas aqui uma imagem em campo claro e uma imagem em luz ultravioleta de cristais em formato de agulha observados somente na condição de assalto. Não foi detectada fluorescência proveniente dos cristais, indicando um falso positivo nesta imagem.

Um cristal em forma de bastonete formou-se quando o metil propanodiol foi usado como precipitante. O cristal fluoresceu fracamente, indicando que poderia ser um cristal proteico, mas revelou-se não proteico por meio de difração de raios X. É mostrado aqui um cristal observado cerca de quatro semanas após o início dos ensaios.

A forte fluorescência sob luz UV confirma que se trata de um cristal de proteína. Como você observou neste vídeo. Uma vez disponíveis os linfócitos B, eles podem ser misturados diretamente com a proteína purificada e, a partir desse ponto, a cristalização prossegue quase exatamente como nos protocolos padrão com detergentes.

Outra vantagem distinta é a capacidade de dopar linfócitos B com lipídios específicos para fins de otimização. Há realmente muita versatilidade com a técnica, e ela é tão simples de usar que deveria ser testada em todos os projetos de cristalização de proteínas de membrana.