Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios

Este procedimento testa a interação proteína-proteína in vivo entre dois reguladores transcricionais de Arabidopsis, denominado seus, abreviado como SEU, e lu holog, ou LUH. Ao utilizar a complementação de fluorescência biomolecular, SEU é fundido ao fragmento terminal N da proteína fluorescente amarela, ou YFP, e LUH é fundido ao fragmento terminal C do Y-F-P-D-N-A das duas construções plasmidiais. SEUS, NYFP e L-U-H-C-Y-F-P são bombardeados em células epidérmicas de cebola para testar sua interação.

Uma interação entre Seuss e LUH promove a associação dos fragmentos terminal N e terminal C da YFP em núcleos, levando à fluorescência da YFP nos núcleos. Após incubação por 16 a 20 horas no escuro, as lâminas de epiderme de cebola são observadas em microscópio de fluorescência para visualizar a fluorescência. Olá, sou Courtney Hollander do laboratório do Dr. Zhi Lu do Departamento de Biologia Celular e Genética Molecular da Universidade de Maryland.

Hoje vamos mostrar um procedimento para testar a interação entre proteínas em células de cebola utilizando o canhão de genes BioRad Helios. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para testar interações entre proteínas e a localização proteica em células vegetais. Então, vamos começar.

Para iniciar este procedimento, prepare cartuchos para a pistola de genes Helios seguindo o Protocolo Joe Video de Woods e Zeto, 2008, que demonstra em detalhes o procedimento de preparação de cartuchos para cada preparação. Cinquenta microgramas de DNA plasmidial total são misturados com 12,5 miligramas de partículas de ouro e solução de PVP a 0,5 miligramas por mililitro para BIFC. Combinando a mesma preparação de cartucho, os dois DNAs plasmidiais das proteínas interagentes putativas Seuss fundidas à metade N-terminal de YFP, abreviado seus, NYFP, e LU Homólogo fundido à metade C-terminal de YFP, abreviado L-U-H-C-Y-F-P.

A quantidade combinada é de 50 microgramas por preparação, produzindo até 50 cartuchos com um micrograma de DNA por 0,25 miligramas de ouro por cartucho. Cada cartucho é para um único disparo. Após a preparação dos cartuchos, teste-os para verificar se as partículas de ouro são eficientemente propelidas.

Envolva um quadrado de paraform em um disco de Petri. Em seguida, ajuste a pressão de hélio entre 150 e 200 PSI e dispare os cartuchos recém-fabricados contra o quadrado de paraform. Observe partículas douradas tênues no paraform.

Podem ser propelidas diferentes quantidades de partículas de ouro sobre o parfum a diferentes pressões de hélio. No entanto, se não houver diferença significativa, escolha a pressão mais baixa para o bombardeamento. Este teste também indica a área coberta por cada disparo.

Para preparar os tecidos de cebola, retire a camada externa de uma cebola amarela grande usando uma lâmina de barbear limpa e afiada. Corte uma área retangular de dois por oito centímetros, com profundidade de quatro a cinco camadas. Retire o tecido retangular de cebola e descarte as duas camadas externas.

Corte as camadas restantes da cebola em pedaços quadrados de aproximadamente 1,5 centímetro. Coloque os pedaços de cebola em uma placa de Petri contendo círculos de papel filtro de três mm. Umedeça com água estéril e cubra a placa de Petri.

Os pedaços de cebola estão prontos para a bombardeação. Primeiro, carregue as cartucheras nos porta-cartuchos brancos e redondos; coloque cartucheras contendo diferentes construtos de plasmídeos em porta-cartuchos diferentes. Cada porta-cartuchos pode acomodar até 12 cartucheras para 12 disparos.

Três suportes diferentes são carregados aqui. O primeiro suporte possui cartuchos contendo 35 S-G-F-P-A, promotor forte e constitutivo do vírus do mosaico do couve-flor. Este plasmídeo serve como controle positivo.

O segundo suporte é carregado com cartuchos experimentais contendo uma quantidade igual de S-E-U-N-Y-F-P e L-U-H-C-Y-F-P. O terceiro suporte de cartucho é carregado com cartuchos contendo uma mistura molar equimolar do vetor puck spine e LUH puck spice. Isso também serve como controle negativo.

Insira a bateria e o revestimento novo do cano na pistola de genes Helios. Certifique-se de que tanto o revestimento do cano quanto a pistola tenham seus respectivos anéis O instalados. Em seguida, insira um porta-cartucho vazio na pistola de genes, com a marcação número 12 no porta-cartucho voltada para o topo da pistola.

Acione o porta-cartucho uma ou duas vezes para garantir que foi inserido corretamente. Em seguida, conecte a pistola ao tanque de hélio e ajuste a pressão entre 150 e 200 PSI. Use proteção auricular e dispare a pistola algumas vezes mantendo o botão lateral pressionado enquanto puxa o gatilho. Disparar a pistola com o porta-cartucho vazio limpa a câmara da pistola e assegura que a pressão está estável.

Antes de bombardear o DNA, bombardear um pedaço de cebola aqui pode servir como controle negativo para a fluorescência de fundo. Para bombardear as partículas de ouro revestidas com DNA, remova o suporte de cartucho vazio e insira o primeiro suporte de cartucho carregado contendo o controle positivo. Avance o suporte de cartucho para que o cartucho destinado ao disparo seja posicionado na parte inferior do suporte de cartucho.

Agora, coloque pedaços de cebola no centro de uma placa de Petri vazia, com a camada mais interna da cebola voltada para cima. Apoie o revestimento do cano da pistola de genes sobre a placa de Petri e dispare a pistola. Avance para o próximo cartucho e dispare em um pedaço diferente de cebola.

Repita este passo até que quatro a cinco pedaços de cebola sejam bombardeados. Cada pedaço de cebola é bombardeado apenas uma vez após o disparo. Transfira o pedaço de cebola bombardeado para uma placa de Petri contendo papel de filtro úmido de três mm para disparar as cartuchagens experimentais.

Altere para o cartucho Holden. Número dois, lembre-se de trocar o revestimento do barril para prevenir contaminação. Dispare quatro a cinco pedaços de cebola conforme mostrado anteriormente para o controle positivo.

Em seguida, mude para o cartucho Holden número três, contendo o DNA controle negativo. E novamente, dispare quatro a cinco pedaços de cebola.

Altere o revestimento do barril para evitar contaminação. Após a bombardeação, cubra as placas de Petri contendo os pedaços de cebola com as tampas.

Envolva-os com parafina para evitar secagem. Incube os pedaços de cebola à temperatura ambiente, no escuro, por 16 a 48 horas. Após a bombardeação, desligue o gás e libere a pressão antes de desconectar a pistola de genes do tanque de hélio, desparafuse o revestimento do cano e remova o suporte do cartucho e os cartuchos usados.

Por fim, limpe os suportes das cartuchas e os revestimentos do barril submergindo-os em um béquer com água e sabão e submetendo-os à ultrassonicação por 20 minutos. Em seguida, enxágue com água para remover todos os resíduos de sabão.

Imprima em etanol 70% por uma hora e, em seguida, seque em papel toalha. Prossiga para observar os pedaços de cebola entre 16 e 20 horas após a bombardeação. Após incubação dos pedaços de cebola bombardeados por 16 a 20 horas à temperatura ambiente, use pinças com pontas planas para descascar lentamente uma única camada de células do epitélio interno da cebola.

Esta é a camada que fica diretamente voltada para a arma durante a bombardeação. Coloque a camada descascada sobre uma gota de água em uma lâmina de microscópio com uma lamínula. Porém, tenha cuidado para minimizar bolhas.

Observe a fluorescência de GFP ou YFP utilizando um microscópio de fluorescência, como o Zeiss Axio Observer, ponto Z um mostrado aqui sob o campo claro do microscópio. Primeiro, verifique o fluxo citoplasmático para garantir que as células estejam vivas. Para tanto.

Exponha a lâmina à luz de campo claro por alguns minutos para aquecer o tecido da cebola e, em seguida, procure o movimento do citoplasma. O fluxo citoplasmático nem sempre é fácil de observar, portanto, não se desanime se não estiver claramente visível. Para detecção por fluorescência, utilize filtros apropriados de excitação e detecção para GFP ou YFP. Verifique também os controles negativos, que são os pedaços de cebola transformados com um plasmídeo não fluorescente.

Sinais amarelos fracos podem aparecer a partir de células danificadas, detritos e cebolas. Além disso, verifique os controles positivos. O plasmídeo contendo o repórter fluorescente expresso constitutivamente.

A fluorescência GFP é observada em algumas, mas não em todas as células. Bolhas de ar também podem gerar fluorescência de fundo. Sinais GFP visíveis em células epidérmicas de cebola indicam que as cartuchos, os tecidos de cebola e o disparo do canhão de genes foram adequadamente preparados e executados.

É mostrada aqui a forte fluorescência observada a partir do plasmídeo positivo para SGFP 35. A intensa fluorescência é visível em toda a célula, incluindo o núcleo e o citoplasma. A imagem de campo claro permite visualizar o contorno correspondente das células e dos núcleos.

Nem todas as células são transformadas. O sinal fluorescente de YFP é detectado no núcleo da célula de cebola quando a combinação experimental Seuss, NYFP e L-U-H-C-Y-F-P é bombardeada nas células de cebola, indicando que Seuss, NYFP e L-U-H-C-Y-F-P interagem in vivo. No entanto, essa fluorescência mediada pela interação é significativamente mais fraca do que a fluorescência mediada por 35 SGFP no controle positivo.

Além disso, os fatores de transcrição SEUS e LUH estão localizados nos núcleos. Assim, a fluorescência YFP é observada apenas no núcleo. Além disso, o número de células fluorescentes é significativamente menor do que o do controle positivo 35 SGFP.

Isso ocorre porque o B FFC só funciona quando ambos os plasmídeos parceiros são expressos nas mesmas células de cebola. Nenhum sinal fluorescente é detectado em cebolas bombardeadas com o porta-cartucho número três, contendo uma mistura de puck spine, vetor e L-U-H-C-Y-F-P, como é esperado para o controle negativo. Acabamos de mostrar como bombardear células de cebola para testar interações entre proteínas utilizando o sistema de canhão genético BioRad Helios.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar controles positivos e negativos apropriados e saber que a fluorescência do BIFC pode ser mais fraca em intensidade e menor em número de células fluorescentes. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.