Complementação de fluorescência bimolecular

Este experimento tem como objetivo definir se duas proteínas interagem em células e delinear aspectos dos sítios dessa interação. Primeiro, as células são transfectadas com construtos de expressão que codificam as duas proteínas de interesse, sendo que uma delas é fundida ao extremo N de uma proteína fluorescente fragmentada e a outra ao extremo C complementar da proteína fluorescente fragmentada. Após permitir que as células transfectadas desenvolvam sinal fluorescente em cultura, os complexos proteicos são visualizados por meio de imagem e imunoblotagem.

Em seguida, as imagens coletadas são exportadas para softwares de análise de imagem, como o Image J, com o objetivo de quantificar a intensidade média de fluorescência por célula. Em um experimento controlado, os resultados de BIFC podem demonstrar interações entre proteínas e a localização desses complexos, como os domínios SH3 da proteína de sustentação (scaffold) intersectina e o domínio rico em prolina da PI3KC2β. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como colocalização, imunoprecipitação e FRET, é que o BFC permite a localização espacial de interações fracas e transitórias na célula. Além disso, este método não exige um processamento extensivo das imagens, como ocorre com o FRET.

Este método pode abordar questões fundamentais na área de transdução de sinal, como se as proteínas X e Y interagem, e, em caso afirmativo, quais são os compartimentos específicos aos quais esses complexos se localizam na célula? Geralmente, iniciantes neste método enfrentarão dificuldades porque não escolheram a configuração adequada para expressar sua biópsia. Proteínas marcadas de interesse iniciam-se pela seleção de um dos múltiplos fluoróforos para as proteínas de fusão BIFC.

Considere que as extremidades amino e carboxi terminais da Venus são capazes de formar um complexo a 37 graus Celsius, enquanto os fragmentos Y-F-P-B-I-F-C requerem uma pré-incubação a 30 graus Celsius. Projete vetores de expressão para a adição de marcadores nas proteínas de interesse, levando em conta como a ligação dos fragmentos BIFC pode afetar a função das proteínas de interesse. Por exemplo, a família RAs, as GTPases são modificadas por lipídios na extremidade carboxi terminal e não podem ser marcadas nessa extremidade sem interromper essa modificação.

Sempre realize experimentos piloto para determinar as condições de transfeção. Além disso, acompanhe as células por microscopia de fluorescência para identificar um tempo ideal para o desenvolvimento do sinal. Em seguida, realize análise por western blot para confirmar a expressão igualitária dos construtos.

Importante imunomarcar o marcador HA ou flag para verificar se a adição dos fragmentos BIFC não altera a localização celular das proteínas de interesse em cada placa de amostra. Semear 1,3 × 10⁵ células em cada placa de fundo de vidro e em dois poços de uma placa de seis poços e deixar as células se aderirem durante a noite em um incubador a 37 °C; no dia seguinte, preparar os DNAs para transfeção por lipofecção ou outro método preferido.

Primeiro, dilua o DNA em 250 microlitros de DMEM sem soro como controle de transfeção. Adicione CFP na proporção de um para cinquenta, em relação à quantidade total dos seus DNAs BIFC. Agora, dilua o lip em 250 microlitros de DMEM sem soro, utilizando 10 microlitros de lip por um micrograma de DNA.

Misture as diluições de DNA e lipídeo e incube à temperatura ambiente por 20 minutos. Lave as células duas vezes com DMEM sem soro aquecido. Adicione dois mililitros de DMEM sem soro a cada placa com fundo de vidro ou poço de uma placa de seis poços.

Em seguida, divida igualmente cada mistura de transfeção entre um recipiente com fundo de vidro e duas cavidades de uma placa de seis poços. Incube as células a 37 graus Celsius por cinco horas. Por fim, remova o meio de transfeção e substitua por meio DMEM completo acrescido de 10% de soro bovino fetal (FBS).

Incube as células pelo tempo determinado em experimentos pilotos para obter os níveis necessários de expressão das proteínas de interesse. Examine as células transfectadas em um microscópio fluorescente de epifluorescência para garantir que o controle positivo esteja fluorescente. Lave as células três vezes com PBS para a aquisição de imagens de células vivas.

Coloque as células em meio sem corantes indicadores. Para aquisição de imagens de células fixadas, adicione paraformaldeído 2% e coloque no gelo por 10 minutos.

Em seguida, lave as células três vezes com PBS, agora cobertas com um mililitro de PBS, e armazene no escuro a quatro graus Celsius, lisando imediatamente as células na placa de seis poços. Para análises de Western blot, é importante que todas as células sejam preparadas ao mesmo tempo, de modo que as células lisadas sejam representativas das células utilizadas na imagem. Realize um Western blot para garantir que as proteínas marcadas sejam expressas em níveis equivalentes.

Ao realizar a imagem de células com um microscópio confocal, é importante manter as configurações constantes durante todo o experimento para que a fluorescência seja comparável entre as amostras. Certifique-se de imaginar células individuais em que os pixels não estejam saturados. Como CFP foi incluído como controle de transfeção, selecione apenas células positivas para CFP para análise dos sinais de BIFC.

Quantifique a fluorescência utilizando um software de imagem, como o ImageJ. Abra os arquivos de imagem no ImageJ. Vá até Analisar e defina as medições. Marque as caixas de área e valor médio de cinza na caixa de medições. Observe que, neste exemplo, as imagens venosas foram coloridas artificialmente de verde e as imagens de CFP, coloridas artificialmente de vermelho.

Usando a ferramenta de seleção manual, desenhe um contorno ao redor da borda de toda a célula no canal CFP, mantendo esse contorno no lugar. Alterne para o canal YFP. Vá até analisar e meça o valor médio de cinza, que reflete a intensidade média de fluorescência por célula para cada imagem.

Desenhe um círculo no canal YFP em uma área que não contenha uma célula. Faça uma medição dessa área como fundo. Subtraia o fundo de cada imagem.

Por fim, para calcular a intensidade média de fluorescência para uma população de células, faça a média do valor médio da graduação subtraído do fundo para todas as células imagiadas em uma amostra. Idealmente, quantifique 60 células ao longo de três experimentos. A proteína de sustentação multidomínio intersectina regula a sobrevivência neuronal por meio da regulação de uma nova classe dois de fosfatidilinositol três quinase, PI três KC dois beta. Os domínios SH três da intersectina interagem com a região rica em prolina do terminal amino de PI três KC dois beta. A transfeção de intersectina marcada com VN juntamente com PI três KC dois beta marcada com VC resulta em um sinal fluorescente no canal YFP, que é pseudocolorido em verde, indicando a formação do complexo.

CFP pseudo-colorido aqui em vermelho é usado como controle para marcar células transfectadas; mutações no domínio rico em prolina da PI três KC dois beta, que interrompem a co-precipitação da intersectina e da PI três KC dois beta, reduzem o sinal de BIFC. Essa diferença no sinal de BIFC não se deve a diferenças na expressão das proteínas tipo selvagem e PA PI três K. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três dias, se executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é necessário lembrar-se de incluir os controles apropriados e verificar a expressão proteica para garantir que as diferenças no sinal de BC se devam à formação do complexo e não à expressão proteica após este procedimento.

Outras técnicas, como o plasma de superfície em residentes, podem ser realizadas para responder perguntas como: quais são as diferentes afinidades desses complexos entre si?