Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

Para testar a interação entre duas proteínas, os dois genes de interesse precisam ser clonados nos vetores BF e utilizando a técnica de clonagem Gateway. Essas construções são transformadas em Agrobacterium GV3101. As culturas bacterianas GV3101 contendo as construções serão misturadas e co-infiltradas nas folhas.

Se as duas proteínas candidatas interagirem entre si, o sinal de YFP pode ser observado utilizando microscopia confocal. O objetivo principal da técnica BFC é testar a interação entre duas proteínas. In vivo, criamos uma série de vetores BFC e ISTO (dois-híbridos) compatíveis com o sistema Gateway, que fornecem aos pesquisadores ferramentas de fácil uso para realizar ensaios de dois-híbridos BFC e ISTO.

Neste vídeo, vamos demonstrar a facilidade de uso do nosso sistema BFC. Para testar as interações entre proteínas de maneira independente do sistema de expressão, primeiro você precisa preparar o cultivo bacteriano GV 3 1 0 1.

Você precisa escolher uma única colônia da sua placa e inocular em cinco mililitros de meio YEB com antibióticos apropriados. Em seguida, você deve agitar esses cultivos durante a noite a 28 graus. A velocidade é de 200 rotações por minuto.

Os cultivos bacterianos devem estar prontos na manhã seguinte. Certifique-se de que as bactérias D cresceram em excesso. Retire os cultivos do incubador e transfira um macho de cada cultura para um tubo estéril de centrífuga de 1,5 mL.

Coloque os tubos de centrífuga em uma centrífuga de bancada. Centrifugue as bactérias a 1000 G durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Em seguida, observe o pellet adicionando um mililitro de meio de infiltração e realize a ressuspensão pipetando algumas vezes.

Repita a etapa de lavagem mais duas vezes. Isso é importante porque ajuda a remover traços de antibióticos no meio bacteriano, o que poderia prejudicar suas plantas após a infiltração. Após a lavagem final, ressuspenda o pellet em 0,5 mL de meio de infiltração e meça a densidade de 600 nm dessa suspensão bacteriana utilizando um espectrofotômetro, com o meio de infiltração como controle em branco.

Após a medição da DO, você precisa ajustar a DO usando o meio de infiltração. A DO final deve estar entre um e 1,2. Você deve preparar todas as suspensões bacterianas antes de prosseguir para o próximo passo.

Transfira quantidades iguais das suspensões bacterianas correspondentes às suas duas proteínas candidatas e misture-as em um novo tubo de 1,5 mL. A mistura bacteriana negativa está agora pronta para infiltração. Prepare todas as combinações e não se esqueça de incluir uma controle negativo. Você deve usar cinco a seis plantas de tabaco *Nicotiana benthamiana* para infiltração.

Você pode remover as plantas da câmara de crescimento e colocá-las sob luz noturna por uma hora antes da infiltração para abrir os estômatos. Isso ajudará no processo de infiltração. Aspire cerca de 100 microlitros de bactérias suspensas em Resus.

Misture próximo a uma seringa masculina com ponta deslizante sem a agulha. Coloque a ponta da seringa contra a face inferior da folha. Apoie o lado superior do joelho com o seu dedo.

Pressione geralmente o êmbolo para baixo. Você deverá ser capaz de ver o líquido se difundindo através da folha, pois ainda sente o mesofilo mais fino. Os espaços aéreos após a infiltração permitem que você marque a área infiltrada com uma caneta de tinta. Caso contrário, após dois dias, você não será capaz de identificar a área infiltrada. Se precisar infiltrar com diferentes misturas bacterianas, certifique-se de pulverizar sua luva com etanol a 50% ou trocar suas luvas entre as infiltrações.

Tente deixar um espaço de uma faixa de um metro entre as infiltrações para evitar contaminação cruzada. Os sinais de PFA devem ser monitorados a cada 24 horas a partir da infiltração, durante até cinco dias. Você pode usar duas capas protetoras de tamanhos diferentes para segurar a amostra.

Primeiro, coloque uma gota de água mini na manga da lamínula. Em seguida, corte um pequeno pedaço de tecido de faca dentro da zona infiltrada. Tente evitar a veia nauseante na amostra.

Coloque o tecido cortado com a lâmina na água sobre a lâmina, cubra-o usando uma lamínula menor e pressione suavemente. Agora a amostra pode ser observada ao microscópio México. Aqui utilizamos este NACA T CSS P dois confocal México para visualizar o sinal BIFC.

Até mesmo um microscópio comum de contraste de fase pode ser utilizado. A microscopia confocal fornece imagens melhores e detecta sinais fracos. Você pode usar o parâmetro YFP para detectar os sinais VFC neste sistema NCAs P dois.

Você pode simplesmente clicar duas vezes neste predefinição de YFP aqui, o que automaticamente ativará a excitação e definirá o intervalo de detecção da emissão. Se você estiver usando um sistema diferente, consulte o manual para configurar corretamente os parâmetros. É nossa expectativa que, após assistir a este vídeo, você seja capaz de realizar o BFCE para testar interações entre proteínas utilizando o sistema de expressão unbe MI Transcend.

Você também pode aplicar este procedimento a plantas de tabaco e AY. Nossos vetores BFC também contêm uma etiqueta HA e uma etiqueta flag, respectivamente, de modo que você também pode realizar co-IP para validar as interações, se necessário.